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摘要：本发明关于经修饰的单指导RNA及双指导RNA，该单指导RNA及双指导RNA在基因编辑方法中具有提高的体外及体内活性。

主权项：1.单指导RNAsgRNA，其包含：1包含指导区的5’末端，其中所述指导区包含20个核苷酸；和2GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mUSEQIDNO:356,其中*表示所述核苷酸与相邻的核苷酸以硫代磷酸酯PS键连接，小写字母“m”表示所述核苷酸以2'-O-Me修饰。

全文数据：经修饰的指导RNA本申请包含本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容通过引用并入本文。2017年12月7日创建的该ASCII拷贝命名为01155-0004-00PCT_SeqList.txt，大小为118,877字节。本申请要求2016年12月8日提交的美国临时申请No.62431,756的优先权，该临时申请通过引用整体并入。本发明涉及使用CRISPRCas系统进行基因编辑的领结构域，CRISPRCas是用以识别及切割外源性遗传元件的原核生物免疫系统的一部分。CRISPRCas系统依赖于称为CRISPR相关蛋白质9CRISPR-associatedprotein9；Cas9的单一核酸酶，其在DNA中诱发位点特异性断裂。Cas9被称为指导RNAguideRNA；gRNA的小RNA分子引导至特定DNA序列。指导RNA包含trRNA也称为tracrRNA及crisprRNAcrRNA。trRNA及crRNA可包含于单指导RNAsgRNA内或双指导RNAdgRNA的两个独立RNA分子中。Cas9并与trRNA及crRNA或sgRNA的组合被称为Cas9核糖核蛋白复合体ribonucleoproteincomplex；RNP。寡核苷酸，尤其是RNA，有时会通过核酸内切酶或核酸外切酶切割，在细胞及血清中降解。需要用于防止这种降解、改善gRNA稳定性和增强基因编辑效率的改进方法及组合物，尤其是对于治疗应用。发明概述在一些实施例中，提供包含经修饰的指导RNA的治疗基因组编辑工具。本文所述的经修饰的指导RNA可改良指导RNA及指导RNACas9复合物的稳定性，且改善Cas9例如SpyCas9及等效物切割标靶DNA的活性。在一些实施方案中，该指导RNA为sgRNA。在一些实施方案中，该指导RNA为dgRNA。在一些实施方案中，该指导RNA为tracrRNA。在一些实施方案中，该指导RNA为crRNA。本文所述的指导RNA包含至少一个经修饰核苷酸。该修饰可包括2'-O-甲基2'-O-Me、2’-O-2-甲氧基乙基2'-O-moe、2’-氟2’-F、核苷酸之间的硫代磷酸酯PS键、G-C取代，及核苷酸之间的反向无碱基键abasiclinkage及其等效物。本发明的实施方案包括：在一些实施方案中，涵盖单指导RNAsgRNA，其包含5’端修饰及以下一个或多个中的一个或多个修饰：上部茎区；发夹1区；及发夹2区，其中5’端修饰包含5’末端的5’端处前七个核苷酸内的至少两个硫代磷酸酯键。在一些情况下，该修饰为经2'-O-甲基2’-O-Me修饰的核苷酸。在一些实施方案中，该修饰为经2’-氟2'-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，sgRNA包含US1至US12处的修饰及或H1-1处的修饰及或H2-1中的修饰。在一些实施方案中，sgRNA包含H1-1至H1-12及或H2-1至H2-15处的修饰。在一些实施方案中，sgRNA包含上部茎区、发夹1区及发夹2区中每一个处的一个或多个修饰。在一些实施方案中，sgRNA包含发夹1区与发夹2区之间的经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，该sgRNA包含下部茎区中的修饰。在一些实施方案中，sgRNA包含5’末端及或3’末端处的修饰。在一些实施方案中，sgRNA包含3’末端中的3’端修饰。在一些实施方案中，sgRNA包含3’末端的3’端处最后四个核苷酸中至少两个处的修饰。在一些实施方案中，该sgRNA包含5’末端中的5’端修饰。在一些实施方案中，sgRNA包含5’末端的5’端处前四个核苷酸中至少两个的修饰。在一些实施方案中，sgRNA包含3’末端中的3’端修饰及5’末端中的5’端修饰。在一些实施方案中，sgRNA包含3’末端的3’端处最后四个核苷酸中至少两个及5’末端的5’端处前四个核苷酸中至少两个的修饰。在一些情况下，这些修饰为2'-O-Me、2'-F、2’-O-moe或连接核苷酸的硫代磷酸酯PS键。在一些实施方案中，sgRNA包含3’末端的3’端处最后四个核苷酸中至少两个及或5’末端的5’端处前四个核苷酸中至少两个之间的PS键。在一些情况下，sgRNA包含具有超过一个如本文所述的修饰的5’末端及3’末端，该修饰诸如PS键及2’-O-Me修饰。在一些实施方案中，sgRNA包含突起区bulgeregion中的修饰。在一些实施方案中，突起区中50％的核苷酸经修饰，其中该修饰为2'-O-Me或2'-F。在一些实施方案中，sgRNA包含连接区nexusregion中的修饰。在一些实施方案中，sgRNA包含连接区中N15、N16、N17及或N18处的修饰，其中该修饰为2'-O-Me或2'-F。在一些情况下，N16、N17及N18与PS键连接。在一些实施方案中，sgRNA包含的5’末端的5’端处至少前三个核苷酸及3’末端的3’端处最后三个核苷酸经修饰。在一些实施方案中，sgRNA包含3’末端及或5’末端处的修饰。在一些情况下，5’末端的5’端处前四个核苷酸及3’末端的3’端处最后四个核苷酸与硫代磷酸酯PS键连接。在一些实施方案中，5’及3’修饰包含2'-O-Me或2'-O-moe。在一些实施方案中，5’及3’修饰包含2'-F。在一些实施方案中，5’及或3’修饰包含连接核苷酸的PS键。在一些实施方案中，5’及或3’修饰包含2’-O-Me、2’-O-moe、2’-F及连接核苷酸的PS键中的一个或多个。在一些实施方案中，sgRNA包含5’末端的5’端处前四个核苷酸及3’末端的3’端处最后四个核苷酸处的修饰。在一些情况下，这些修饰为连接PS键也即连接前四个及最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，sgRNA进一步包含5’末端的5’端处前三个核苷酸及3’末端的3’端处最后三个核苷酸处的2'-O-Me修饰。在一些实施方案中，sgRNA包含5’末端的5’端处的前四个核苷酸及3’末端的3’端处的最后四个核苷酸处的修饰，其中修饰至少为连接四个核苷酸的PS键，且另外，其中5’末端的5’端处的前三个核苷酸及3’末端的3’端处的最后三个核苷酸包含2'-O-Me、2'-O-moe或2'-F修饰。在一些实施方案中，sgRNA包含修饰LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12，其中修饰为2'-O-Me或2’-F。在一些实施方案中，sgRNA包含突起区中的核苷酸中的每一个处的修饰，其中该修饰为2'-O-Me或2’-F。在一些实施方案中，sgRNA包含上部茎区中的核苷酸中的每一个处的修饰，其中该修饰为2'-O-Me或2'-F。在一些实施方案中，sgRNA包含发夹1区中的核苷酸中的每一个处的修饰，其中该修饰为2'-O-Me或2’-F。在一些实施方案中，sgRNA包含发夹2区中的核苷酸中的每一个处的修饰，其中该修饰为2'-O-Me或2'-F。在一些实施方案中，涵盖sgRNA，其包含以下位置处的2'-O-Me修饰核苷酸：a.5’末端的5’端处的前三个核苷酸；b.下部茎区中的LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及或LS12；c.突起区中的B1及或B2；d.上部茎区中的各核苷酸；e.连接区中的N16、N17及或N18；f.发夹1区中的各核苷酸；g.发夹2区中的各核苷酸；及h.3’末端的3’端处的最后四个核苷酸。在一些实施方案中，B3至B6经2'-O-Me修饰。在一些情况下，sgRNA进一步包含三个连接5’末端的5’端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键，及三个连接3’末端的3’端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，sgRNA包含LS9及LS10处的2'-F修饰。在一些实施方案中，sgRNA包含N15、N16、N17及N18处的2’F修饰。在一些实施方案中，该sgRNA包含H2-9、H2-10、H2-11、H2-12、H2-13、H2-14及H2-15处的2’F修饰。在一些实施方案中，sgRNA包含3’末端的3’端处的倒数第二个、倒数第三个及倒数第四个核苷酸处的2’F修饰。在一些实施方案中，涵盖sgRNA，其包含以下位置处的2'-F修饰核苷酸：a.下部茎区中的LS9及LS10；b.连接区中的N15、N16、N17及N18；及c.发夹2区中的H2-9、H2-10、H2-11、H2-12、H2-13、H2-14及H2-15。在一些实施方案中，sgRNA包含3’末端处的倒数第二个、倒数第三个及倒数第四个核苷酸处的2'-F修饰核苷酸。在一些实施方案中，sgRNA包含三个连接5’末端的5’端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键，及三个连接3’末端的3’端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，sgRNA包含5’末端的5’端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me或2'-F修饰核苷酸及3’末端的3’端处的最后四个核苷酸中的三个处的2'-O-Me或2'-F修饰核苷酸。在一些实施方案中，涵盖sgRNA，其包含：a.5’末端的5’端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；b.LS1及或LS6处的任选的2’-O-Me修饰核苷酸；c.US至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；d.H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；e.发夹1区与发夹2区之间的任选的2'-O-Me修饰核苷酸；f.H2-1至H2-15处的2'-O-Me修饰核苷酸；及g.3’末端的3’端处的最后四个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；且任选进一步包含三个连接5’末端的5’端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端的3’端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，涵盖sgRNA，其包含：a.5’末端的5’端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸；b.LS1至LS6处的2’-F修饰核苷酸；c.US1至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；d.H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；e.发夹1区与发夹2区之间的2’-O-Me修饰核苷酸；f.H2-1至H2-15处的2'-O-Me修饰核苷酸；及g.3’末端的3’端处的最后四个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；且任选进一步包含三个连接5’末端的5’端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端的3’端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，涵盖sgRNA，其包含：a.5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；b.LS2至LS5处的2'-F修饰核苷酸；c.LS1及LS6处的2'-O-Me修饰核苷酸；d.US1至US12处的2'-O-Me修饰核苷酸；e.H1-1至H1-12处的2'-O-Me修饰核苷酸；f.发夹1区与发夹2区之间的2'-O-Me修饰核苷酸；g.H2-1至H2-15处的2'-O-Me修饰核苷酸；及h.3’末端处的最后四个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸，且任选进一步包含三个连接5’末端的5’端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端的3’端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，涵盖sgRNA，其包含：a.5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；b.US1至US12处的2'-O-Me修饰核苷酸；c.LS7、LS8、LS11及LS12处的2’-O-Me修饰核苷酸；d.H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；e.发夹1区与发夹2区之间的2'-O-Me修饰核苷酸；f.H2-1至H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；及g.3’末端处的最后四个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸，且任选进一步包含三个连接5’末端的5’端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端的3’端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，涵盖sgRNA，其包含：a.5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；b.US1至US12处的2'-O-Me修饰核苷酸；c.LS7、LS8、LS11及LS12处的2’-O-Me修饰核苷酸；d.LS9及LS10处的2'-F修饰核苷酸；e.H1-1至H1-12处的2'-O-Me修饰核苷酸；f.发夹1区与发夹2区之间的2'-O-Me修饰核苷酸；g.H2-1至H2-15处的2'-O-Me修饰核苷酸；及h.3’末端处的最后四个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸，且任选进一步包含三个连接5’末端的5’端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端的3’端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，涵盖sgRNA，其包含：a.5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；b.US1至US12处的2'-O-Me修饰核苷酸；c.LS8、LS10及LS12处的2'-O-Me修饰核苷酸；d.LS7、LS9及LS11处的2'-O-F修饰的核苷酸；e.H1-1至H1-12处的2'-O-Me修饰核苷酸；f.发夹1区与发夹2区之间的2’-O-Me修饰核苷酸；g.H2-1至H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；及h.3’末端处的最后四个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸，且任选进一步包含三个连接5’末端的5’端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端的3’端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，涵盖sgRNA，其包含：a.5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；b.LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12处的2’-O-Me修饰核苷酸c.US1至US12处的2'-O-Me修饰核苷酸；d.H1-1至H1-12处的2'-O-Me修饰核苷酸；e.发夹1区与发夹2区之间的2’-O-Me修饰核苷酸；f.H2-1至H2-15处的2'-O-Me修饰核苷酸；及g.3’末端处的最后四个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸，且任选进一步包含三个连接5’末端的5’端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端的3’端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，涵盖sgRNA，其包含：a.5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；b.LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12处的2’-O-Me修饰核苷酸；c.LS9及LS10处的2’-F修饰核苷酸；d.US1至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；e.H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；f.发夹1区与发夹2区之间的2’-O-Me修饰核苷酸；g.H2-1至H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；及h.3’末端处的最后四个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸，且任选进一步包含三个连接5’末端的5’端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端的3’端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，涵盖sgRNA，其包含：a.5’末端的5’端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；b.US1至US12处的2'-O-Me修饰核苷酸；c.H1-1至H1-12处的2'-O-Me修饰核苷酸；d.发夹1区与发夹2区之间的2'-O-Me修饰核苷酸；e.H2-1至H2-8处的2’-O-Me修饰核苷酸；f.H2-9至H2-15处的2'-F修饰核苷酸；g.3’末端处的倒数第二个、倒数第三个及倒数第四个核苷酸处的2'-F修饰核苷酸；及h.3’末端处的最后一个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸，且任选进一步包含三个连接5’末端的5’端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端的3’端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，涵盖sgRNA，其包含：a.5’末端的5’端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；b.US1至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；c.H1-2、H1-4、H1-6、H1-8、H1-10及H1-12处的2'-O-Me修饰核苷酸；d.H1-1、H1-3、H1-5、H1-7、H1-9及H1-11处的2’-F修饰核苷酸；e.发夹1区与发夹2区之间的2’-F修饰核苷酸；f.H2-2、H2-4、H2-6、H2-8、H2-10、H2-12及H2-14处的2’-F修饰核苷酸；g.H2-1、H2-3、H2-5、H2-7、H2-9、H2-11、H2-13及H2-15处的2'-O-Me修饰核苷酸；h.3’末端处的倒数第二个及倒数第四个核苷酸处的2'-F修饰核苷酸；及i.3’末端的3’端处的倒数第三个及最后一个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸，且任选进一步包含三个连接5’末端的5’端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端的3’端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，涵盖sgRNA，其包含：a.LS8、LS10、LS12、H1-2、H1-4、H1-6、H1-8、H1-10、H1-12、H2-1、H2-3、H2-5、H2-7、H2-9、H2-11、H2-13及H2-15处的2'-O-Me修饰核苷酸；及b.LS7、LS9、LS11；H1-1、H1-3、H1-5、H1-7、H1-9、H1-11、H1-13、H2-2、H2-4、H2-6、H2-8、H2-10、H2-12及H2-14处的2'-F修饰核苷酸，且任选进一步包含三个连接5’末端的5’端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键，及三个连接3’末端的3’端处的最后四个核苷酸的PS键；且任选进一步包含：c.3’末端的3’端处的最后一个及倒数第三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；及或d.3’末端的3’端处的倒数第二个、倒数第四个及或最后一个核苷酸处的2'-F修饰核苷酸。在一些实施方案中，涵盖sgRNA，其包含SEQIDNo：228至353中任一个的核酸，包括表4的修饰。在一些实施方案中，涵盖sgRNA，其包含SEQIDNo：228至332中任一个，包括表4的修饰。在一些实施方案中，涵盖sgRNA，其包含SEQIDNo：235至240、265至285及309至329中任一个，包括表4的修饰。在一些实施方案中，涵盖sgRNA，其包含SEQIDNo：240。在一些实施方案中，涵盖sgRNA，其包含SEQIDNo：240，包括表4的修饰。在一些实施方案中，涵盖sgRNA，其包含SEQIDNo：242。在一些实施方案中，涵盖sgRNA，其包含SEQIDNo：358。在其他实施方案中，sgRNA包含与SEQIDNo：235至240、265至285及309至329中任一个核酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70％同一性的核酸，其中对应于表4中的参考序列标识符的核苷酸的sgRNA的各核苷酸处的修饰与表4中的参考序列标识符中示出的修饰相同或等效，任选进一步包含三个连接5’末端的5’端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键，及三个连接3’末端的3’端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，sgRNA进一步包含至少三个连接发夹1区中的核苷酸的PS键。在一些实施方案中，sgRNA进一步包含至少三个连接发夹2区中的核苷酸的PS键。在一些实施方案中，sgRNA进一步包含至少三个连接上部茎区中的核苷酸的PS键。在一些实施方案中，sgRNA与酿脓链球菌S.pyogenesCas9形成核糖核蛋白复合体。附图简述图1显示在通过经修饰的crRNA连同Cas9mRNA及未经修饰的trRNATR000002转染Neuro2A细胞之后，通过小鼠运甲状腺素蛋白TTR基因的第二代测序NGS所测量的编辑％。图2显示在通过经修饰的trRNA连同未经修饰的crRNACR000686及Cas9mRNA转染Neuro2A细胞之后，通过小鼠TTR基因的NGS所测量的编辑％。图3显示在通过Cas9mRNA及具有未发现于亲本序列中的G-C配对的crRNA及trRNA转染Neuro2A细胞之后，通过小鼠TTR基因的NGS所测量的编辑％。图4显示在通过经修饰的crRNA、trRNA连同Cas9mRNA转染Neuro2A细胞之后，通过小鼠TTR基因的NGS所测量的编辑％。标准差遵循该值。图5显示在通过经修饰的sgRNA连同Cas9mRNA转染Neuro2A细胞之后，通过小鼠TTR基因的NGS所测量的编辑％。图6显示在通过经修饰的crRNA、未经修饰的trRNATR000002连同Cas9mRNA转染Neuro2A细胞之后，通过小鼠TTR基因的NGS所测量的编辑％。星号表示出于技术原因在此实验中不显示活性的双指导。此双指导在图9中表示的实验中再次测试，该双指导在其中显示编辑活性。图7显示在通过未经修饰的crRNACR000686、经修饰的trRNA连同Cas9mRNA转染Neuro2A细胞之后，通过小鼠TTR基因的NGS所测量的编辑％。图8显示在通过Cas9mRNA、crRNA，及具有未发现于亲本序列中的G-C配对或G-U错配的trRNA配对转染Neuro2A细胞之后，通过小鼠TTR基因的NGS所测量的编辑％。图9显示在通过经修饰的crRNA、经修饰的trRNA连同Cas9mRNA转染Neuro2A细胞之后，通过小鼠TTR基因的NGS所测量的编辑％。标准差遵循该值。图10显示在通过经修饰的sgRNA连同Cas9mRNA转染Neuro2A细胞之后，通过小鼠TTR基因的NGS所测量的编辑％。图11显示在通过经修饰的sgRNA连同Cas9mRNA转染Neuro2A细胞之后，通过小鼠因子VIIFVII基因的NGS所测量的编辑％。图12A及12B显示在通过经修饰的crRNA及未经修饰的trRNA连同Cas9mRNA转染Neuro2A细胞之后，通过小鼠TTR图12A或FVII图12B的NGS所测量的编辑％。图13A及13B显示在通过经修饰的trRNA及未经修饰的crRNA连同Cas9mRNA转染Neuro2A细胞之后，通过小鼠TTR图13A或FVII图13B的NGS所测量的编辑％。图14A、14B、14C及14D显示在体内施用包含Cas9mRNA及sgRNA的LNP之后，血清中的干扰素αIFN-α，14A、白介素6IL-6，14B、单核细胞趋化蛋白1monocytechemotacticprotein1，MCP-1，14C及肿瘤坏死因子aTNF-α，14D的水平。图15A、15B及15C显示在施用包含Cas9mRNA及sgRNA的LNP之后的体内结果。图15A显示肝中总编辑的百分比。图15B显示血清TTR水平。图15C显示图15A的结果的平均值及标准差。图15D概括对G000209sgRNASEQIDNO：228的修饰。图15E概括对G000267sgRNASEQIDNO：234的修饰。在图15D及15E中，呈粗体的核苷酸经2’-O-Me修饰。图16A、16B、16C及16D显示在体内施用包含Cas9mRNA及sgRNA的LNP之后，血清中的干扰素aIFN-a，16A、肿瘤坏死因子αTNF-a，16B、白介素6IL-6，16C及单核细胞趋化蛋白1MCP-1，16D的水平。图17A、17B、17C及17D显示在施用包含Cas9mRNA及sgRNA的LNP之后的体内结果。图17A显示肝中总编辑的百分比。图17B显示图17A的结果的平均值及标准差。图17C显示血清TTR水平。图17D显示图17B的结果的平均值及标准差。图18A、18B及18C显示在施用包含Cas9mRNA及sgRNA的LNP之后的体内结果。图18A显示肝中总编辑的百分比。图18B概括肝编辑数据。图18C显示血清TTR水平。MPK＝毫克公斤；BLOD＝低于检测水平。图19A、19B、19C及19D显示在体内施用包含Cas9mRNA及sgRNA的LNP之后，血清中的干扰素αIFN-α，19A、单核细胞趋化蛋白1MCP-1，19B、白介素6IL-6，19C及肿瘤坏死因子αTNF-α，19D的水平。图20A及20B显示在体内施用包含Cas9mRNA及sgRNA的LNP之后，FVII基因座图20A及TTR基因座图20B的肝中编辑。图21A、21B及21C显示注释的sgRNASEQIDNO：341图21A、未注释的dgRNACR000686SEQIDNO：1及TR000002SEQIDNO：188图21B，注释的dgRNACR000686SEQIDNO：1及TR000002SEQIDNO：188图21C的示意图。图22A、22B及22C显示在施用包含Cas9mRNA及sgRNA的LNP之后的体内结果。图22A显示肝中的TTR基因座的总编辑的百分比。图22B概括肝编辑数据。图22C显示血清TTR水平。图23A、23B及23C显示在施用包含Cas9mRNA及sgRNA的LNP之后的体内结果。图23A显示肝中的TTR基因座的总编辑的百分比。图23B概括肝编辑数据。图23C显示血清TTR水平。图24A、24B及24C显示在施用包含Cas9mRNA及sgRNA的LNP后，原代小鼠肝细胞中的编辑。FIG24A显示TTR基因座的总编辑的编辑百分比。FIG24B显示随用于计算EC50的mRNA剂量而变的编辑百分比的归一化变换。图24C显示测试的LNP的EC50值。发明详述本文提供用于基因编辑方法的经修饰的指导RNA，包括双指导RNA及单指导RNA。经修饰的指导相比于其未经修饰的对应物更稳定且显示改良的体外及体内功效。经改造及测试的指导RNA的序列显示于表4中。“指导RNA”及“gRNA”在本文中可互换使用，共同指代sgRNA、trRNA也称为tracrRNA或crRNA也称为CRISPRRNA。crRNA及trRNA可以联合在一个RNA分子上单指导RNA[sgRNA]或呈两个分开的RNA分子双指导RNA[dgRNA]联合。“指导RNA”或“gRNA”是指各类型。trRNA序列可为天然存在的，或相比于天然存在的序列，trRNA序列可包括修饰或变化。如本文所用的“编辑效率”或“编辑百分比”或“编辑％”为相比于通过CasRNP之后的序列读段sequenceread总数，具有插入或缺失的核苷酸进入目的靶区结构域的序列读段的总数。如本文所用的“发夹”描述当核酸链折叠且与相同链的另一部分形成碱基对时产生的核酸环。发夹可形成包含环或U-形的结构。在一些实施方案中，发夹可由RNA环组成。发夹可由在单一核酸分子中结合在一起的两个互补序列形成，伴以分子的折叠或皱褶wrinkling。在一些实施方案中，发夹包含茎或茎环结构。如本文所用的“区结构域”描述保守核酸组。区也可称为“模块”或“结构域”。gRNA的区可执行特定功能，例如引导RNP的核酸内切酶活性，例如如BrinerAE等人，MolecularCell56：333-3392014中所述。gRNA的区描述于表1-3中。如本文所用的“核糖核蛋白”RNP或“RNP复合物”描述gRNA，例如连同核酸酶，诸如Cas蛋白质。在一些实施方案中，RNP包含Cas9及gRNA。如本文所用的“茎环”描述形成结束于不成对核酸的环中的碱基配对“茎”的核苷酸的二级结构。具有相同核酸链的两个区在以相反方向读取时，序列至少部分互补的情况下，可形成茎。如本文所用的“环”描述可能覆盖茎的不碱基配对也即不互补的核苷酸的区。“四核苷酸环”描述4个核苷酸的环。如本文所用，sgRNA的上部茎可包含四核苷酸环。在涉及dgRNA的某些实施方案中，如本文所用的“茎”区描述在crRNA与trRNA的某些区例如各RNA的下部与上部茎区之间形成碱基配对区的核苷酸的二级结构。dgRNA的“茎”区也可在此项技术中称作“旗杆”区。如本文所用的“治疗”涵盖任何施用或施用用于个体的疾病的治疗剂，且包括抑制疾病、遏制其发展、缓解疾病的一种或多种症状、治愈疾病或预防疾病的一种或多种症状的复发。1.修饰类型A.2’-O-甲基修饰相信经修饰的糖控制核苷酸糖环的皱褶，该皱褶为影响寡核苷酸对于互补链的结合亲和力、双螺旋形成及与核酸酶的相互作用的物理特性。糖环上的取代可因此改变这些糖的确认及皱褶。举例而言，2’-O-甲基2’-O-Me修饰可增加寡核苷酸的结合亲和力及核酸酶稳定性，尽管如实例中所示，寡核苷酸中的给定位置处的任何修饰的效应需要凭经验确定。术语“mA”、“mC”、“mU”或“mG”是用于指示已经2'-O-Me修饰核苷酸。2'-O-甲基核糖核苷酸形式的核糖核苷酸的修饰可如下描绘：B.2’-O-2-甲氧基乙基修饰在一些实施方案中，修饰可为2’-O-2-甲氧基乙基2'-O-moe。2'-O-moe核糖核苷酸形式的核糖核苷酸的修饰可如下描绘：术语“moeA”、“moeC”、“moeU”或“moeG”是用于指示已经2'-O-moe修饰的核苷酸。C.2’-氟修饰已显示影响核苷酸糖环的另一化学修饰为卤素取代。举例而言，核苷酸糖环上的2’-氟2’-F取代可增加寡核苷酸结合亲和力及核酸酶稳定性。在本申请案中，术语“fA”、“fC”、“fU”或“fG”是用于指示已经2'-F取代的核苷酸。2'-F的取代可如下描绘：D.硫代磷酸酯修饰硫代磷酸酯PS连接或键是指硫取代磷酸二酯连接，例如核苷酸碱基之间的键中的一个非桥联磷酸酯氧的键。当硫代磷酸酯用于产生寡核苷酸时，经修饰的寡核苷酸也可称为S-寡核苷酸。“＊”是用于描绘PS修饰。在本申请案中，术语A＊、C＊、U＊或G＊是用于指示连接至具有PS键的下一个例如3’核苷酸的核苷酸。在本申请案中，术语“mA＊”、“mC＊”、“mU＊”或“mG＊”是用于指示已经2’-O-Me取代且连接至具有PS键的下一个例如3’核苷酸的核苷酸。类似地，术语“fA＊”、“fC＊”、“fU＊”或“fG＊”是用于指示已经2'-F取代且连接至具有PS键的下一个例如3’核苷酸的核苷酸。本文所述的实施方案涵盖PS连接或键的等效物。下图显示将S-取代为非桥联磷酸酯氧，产生PS键来替代磷酸二酯键：E.G-C取代在一些实施方案中，gRNA经不包含化学修饰的序列取代修饰。在一些实施方案中，修饰的gRNA用G-C配对例如，在下部和或上部茎区中改造，这在亲代gRNA序列中未发现。在一些实施方案中，经修饰的gRNA经未发现于亲本gRNA序列中的G-U错配“GU摆动GUwobbles”或错配的配对改造。E反向无碱基修饰无碱基核苷酸是指缺乏含氮碱基的那些核苷酸。下图描绘具有缺乏碱基的无碱基也称为脱嘌呤位点的寡核苷酸：反向碱基是指具有自正常5’至3’键反向的键也即5’至5’键或3’至3’键的那些碱基。举例而言：无碱基核苷酸可连接反向键。举例而言，无碱基核苷酸可经由5’至5’键连接至末端5’核苷酸，或无碱基核苷酸可经由3’至3’键连接至末端3’核苷酸。末端5’或3’核苷酸处的反向无碱基核苷酸也可称作反向无碱基端帽。在本申请案中，术语“invd”指示反向无碱基核苷酸键。以上修饰及其等效物包括在本文所述的实施方案的范畴内。2.指导RNA组合物本发明涵盖包含指导RNA的组合物。在一些实施方案中，指导RNA包含trRNA。在一些实施方案中，指导RNA包含crRNA。在一些实施方案中，指导RNA包含crRNA及trRNA。在一些实施方案中，指导RNA在一个RNA分子上包含crRNA及trRNA作为sgRNA。在一些实施方案中，指导RNA在两个RNA分子上包含crRNA及trRNA作为dgRNA。在dgRNA中，两个RNA分子可经由碱基配对结合associate。在一些实施方案中，指导RNA包含5’末端区。在一些实施方案中，指导RNA不包含5’末端区。在一些实施方案中，5’末端区包含如关于sgRNA在BrinerAE等人，MolecularCell56：333-3392014中所述的“间隔”区但在本文中适用于所有指导RNA。在一些实施方案中，5’末端区包含5’端修饰。具有或不具有间隔区的5’末端区可与crRNA、trRNA、sgRNA及或dgRNA结合。间隔区在本文中且由其他文献有时也称为“指导区”、“指导结构域”或“目标结构域”。如本文所用的“靶序列”是指引导区结构域指导核酸酶切割的核酸序列。在一些实施方案中，spyCas9蛋白可被指导区结构域通过间隔区中存在的核苷酸导向靶核酸分子的靶序列。在一些实施方案中，指导RNA不包含间隔区。在一些实施方案中，本文所述的指导RNA包含或由表4中示出的序列中任一个组成。然而，应注意，当序列显示指导间隔区时，应认识到，组合物可包含或不包含此区。另外，涵盖指导RNA，其包含表4中示出及SEQIDNo标识的序列中任一个的修饰。也即，核苷酸可相同或不同，但显示的修饰模式可与表4的指导序列的修饰模式相同或类似。修饰模式包括gRNA或gRNA区例如5’末端区、下部茎区、突起区、上部茎区、连接区、发夹1区、发夹2区、3’末端区的修饰的相对定位及种类identity。在一些实施方案中，修饰模式含有表4的序列栏中示出的序列中任一个的修饰，或经该序列的一个或多个区的修饰的至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％及99％。在一些实施方案中，修饰模式与表4的序列栏中示出的序列中任一个的修饰模式至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％及99％相同。在一些实施方案中，修饰模式经表4中示出的序列的一个或多个区，例如5’末端区、下部茎区、突起区、上部茎区、连接区、发夹1区、发夹2区及或3’末端区至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％及99％相同。例如，在一些实施方案中，涵盖指导RNA，其中修饰模式与经5’末端区的序列的修饰模式至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％及99％相同。在一些实施方案中，涵盖指导RNA，其中修饰模式与下部茎区至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％及99％相同。在一些实施方案中，涵盖指导RNA，其中修饰模式与突起区至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％及99％相同。在一些实施方案中，涵盖指导RNA，其中修饰模式与上部茎区至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％及99％相同。在一些实施方案中，涵盖指导RNA，其中修饰模式与连接区至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％及99％相同。在一些实施方案中，涵盖指导RNA，其中修饰模式与发夹1区至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％及99％相同。在一些实施方案中，涵盖指导RNA，其中修饰模式与发夹2区至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％及99％相同。在一些实施方案中，涵盖指导RNA，其中修饰模式与3’末端区至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％及99％相同。在一些实施方案中，修饰模式在0、1、2、3、4、5或6个核苷酸处不同于表4的序列，或此类序列的区例如5’末端、下部茎、突起、上部茎、连接、发夹1、发夹2、3’末端的修饰模式。在一些实施方案中，gRNA包含在0、1、2、3、4、5或6个核苷酸处不同于表4的序列的修饰的修饰。在一些实施方案中，gRNA包含在0、1、2、3、4、5或6个核苷酸处不同于表4的序列的区例如5’末端、下部茎、突起、上部茎、连接、发夹1、发夹2、3’末端的修饰的修饰。在一些实施方案中，gRNA包含2'-O-甲基2'-O-Me修饰的核苷酸。在一些实施方案中，gRNA包含2’-O-2-甲氧基乙基2'-O-moe修饰的核苷酸。在一些实施方案中，gRNA包含2’-氟2'-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，gRNA包含核苷酸之间的硫代磷酸酯PS键。在一些实施方案中，gRNA包含5’端修饰、3’端修饰或5’及3’端修饰。在一些实施方案中，5’端修饰包含核苷酸之间的硫代磷酸酯PS键。在一些实施方案中，5’端修饰包含2'-O-甲基2'-O-Me、2’-O-2-甲氧基乙基2'-O-moe及或2’-氟2'-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，5’末端修饰包含至少一个硫代磷酸酯PS键及2'-O-甲基2'-O-Me、2’-O-2-甲氧基乙基2'-O-moe及或2’-氟2'-F修饰的核苷酸中的一个或多个。末端修饰可包含硫代磷酸酯PS、2'-O-甲基2’-O-Me、2’-O-2-甲氧基乙基2’-O-moe及或2’-氟2'-F修饰。本文所述的实施方案也涵盖等效末端修饰。在一些实施方案中，gRNA包含与gRNA的一个或多个区的修饰组合的末端修饰。A.sgRNA的组合物在一些实施方案中，本发明的组合物及方法包含gRNA，其包含将诸如Cas9的核酸酶引导至标靶DNA序列的crRNA及trRNA。在一些实施方案中，本文所述的gRNA可结合在一个RNA分子上单指导RNA或sgRNA。在一些实施方案中，本发明包含sgRNA，其包含或由SEQIDNo：228至332中所述的序列中任一个组成。在一些实施方案中，提供包含SEQIDNo：235至240、265至285及309至329的经修饰序列中任一个的sgRNA。在一些实施方案中，涵盖sgRNA，其包含SEQIDNo：235至240、265至285及309至329的经修饰序列中任一个，其中sgRNA进一步包含与靶序列互补的5’“间隔”序列“指导序列”，且将Cas9引导至其标靶以进行切割。在一些情况下，本发明包含sgRNA，其包含与SEQIDNo：235至240、265至285及309至329中任一个的核酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70％同一性的核酸，其中修饰模式与参考序列标识符中示出的修饰模式相同。1.sgRNA的结构域BrinerAE等人，MolecularCell56：333-3392014描述在本文中称为“结构域”的sgRNA的功能性结构域，包括负责靶向的“间隔”结构域、“下部茎”、“突起”、“上部茎”其可包括四核苷酸环、“连接”及“发夹1”及“发夹2”结构域。参见Briner等人，第334页，图1A。表1及图21A提供如本文所用的sgRNA的结构域的描述。在表1中，区之间的“n”表示核苷酸的可变数目，例如0到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大。在一些实施方案中，n等于0。在一些实施方案中，n等于1。表1：sgRNA的区线性查看，5’至3’LS1-6B1-2US1-12B3-65′末端区n下部茎区n隆突区n上部茎区n隆突区n下文继续LS7-12N1-18H1-1至H1-12H2-1至H2-15下部茎区n连接区n发夹1区n发夹2区3′末端区a5’末端区在一些实施方案中，sgRNA包含如表1中所示的5’末端处的核苷酸。在一些实施方案中，sgRNA的5’末端包含用以将Cas蛋白质引导至靶核苷酸序列的间隔区或指导区。在一些实施方案中，5’末端不包含间隔区或指导区。在一些实施方案中，5’末端包含间隔子及不用以将Cas蛋白质引导至靶核苷酸区的其他核苷酸。在一些实施方案中，指导区包含sgRNA的5’端处的前1至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方案中，指导区包含20个核苷酸。在一些实施方案中，指导区可包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或超过25个核苷酸。在一些实施方案中，指导区可包含17个核苷酸。在一些实施方案中，指导区可包含18个核苷酸。在一些实施方案中，指导区可包含19个核苷酸。在一些实施方案中，指导区的选择是基于用于编辑的目的基因内的靶序列而判定。举例而言，在一些实施方案中，sgRNA包含与目的基因的靶序列互补的指导区。在一些实施方案中，目的基因中的靶序列可与sgRNA的指导区互补。在一些实施方案中，sgRNA的指导区与目的基因中的其对应靶序列之间的互补性或同一性程度可为约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，sgRNA的指导区与目的基因的靶区结构域可100％互补或一致。在其他实施方案中，sgRNA的指导区及目的基因的靶区结构域可含有至少一个错配。举例而言，sgRNA的指导区及目的基因的靶序列可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个错配，其中靶序列的总长度为至少约17、18、19、20碱基对或超过20个碱基对。在一些实施方案中，sgRNA的指导区及目的基因的靶区结构域可含有1至6个错配，其中指导序列包含至少约17、18、19、20个核苷酸或超过20个核苷酸。在一些实施方案中，sgRNA的指导区及目的基因的靶区结构域可含有1、2、3、4、5或6个错配，其中指导序列包含约20个核苷酸。5’末端可包含不视为指导区也即不用以将cas9蛋白质引导至靶核酸的核苷酸。b下部茎区在一些实施方案中，sgRNA包含当线性地查看时，由突起区及上部茎区分离的下部茎LS区。参见表1。在一些实施方案中，下部茎区包含1至12个核苷酸，例如在一个实施方案中，下部茎区包含LS1至LS12。在一些实施方案中，下部茎区包含比表1及图21A中所示出少的核苷酸。在一些实施方案中，下部茎区包含比表1及图21A中所示出多的核苷酸。当下部茎区包含比表1及图21A的示意图中所示出少或多的核苷酸时，应维持如本领域技术人员显而易见的修饰模式。在一些实施方案中，当以相反方向读取时，下部茎区具有核酸序列互补的核苷酸。在一些实施方案中，下部茎区的核酸序列中的互补性产生sgRNA中的茎的二级结构例如该区可彼此碱基配对。在一些实施方案中，当以相反方向读取时，下部茎区可不彼此完全互补。c突起区在一些实施方案中，sgRNA包含突起区，其包含六个核苷酸B1至B6。当线性地查看时，突起区分为两个区。参见表1。在一些实施方案中，突起区包含六个核苷酸，其中前两个核苷酸之后为上部茎区，接着为突起区之后四个核苷酸。在一些实施方案中，突起区包含比表1及图21A中所示出少的核苷酸。在一些实施方案中，突起区包含比表1及图21A中所示出多的核苷酸。当突起区包含比表1及图21A的示意图中所示出少或多的核苷酸时，应维持如本领域技术人员显而易见的修饰模式。在一些实施方案中，突起区的存在导致sgRNA中的上部与下部茎模块之间的定向扭结。d上部茎区在一些实施方案中，sgRNA包含上部茎区，其包含12个核苷酸。在一些实施方案中，上部茎区包含环序列。在一些情况下，环为四核苷酸环由四个核苷酸组成的环。在一些实施方案中，上部茎区包含比表1及图21A中所示出少的核苷酸。在一些实施方案中，上部茎区包含比表1及图21A中所示出多的核苷酸。当上部茎区包含比表1及图21A的示意图中所示出少或多的核苷酸时，应维持如本领域技术人员显而易见的修饰模式。在一些实施方案中，当以相反方向读取时，上部茎区具有核酸序列互补的核苷酸。在一些实施方案中，上部茎区的核酸序列中的互补性产生sgRNA中的茎的二级结构例如该区可彼此碱基配对。在一些实施方案中，当以相反方向读取时，上部茎区可不彼此完全互补。e连接区在一些实施方案中，sgRNA包含位于下部茎区与发夹1区之间的连接区。在一些实施方案中，连接区包含18个核苷酸。在一些实施方案中，连接区包含如表1及图21A中所示的核苷酸N1至N18。在一些实施方案中，连接区包含比表1及图21A中所示出少的核苷酸。在一些实施方案中，连接区包含比表1及图21A中所示出多的核苷酸。当连接区包含比表1及图21A的示意图中所示出少或多的核苷酸时，应维持如本领域技术人员显而易见的修饰模式。在一些实施方案中，当以相反方向读取时，连接区具有核酸序列互补的核苷酸。在一些实施方案中，核酸序列中的互补性产生sgRNA中的茎及或茎环的二级结构例如连接区中的某些核苷酸可彼此碱基配对。在一些实施方案中，当以相反方向读取时，连接区可不彼此完全互补。f发夹区在一些实施方案中，sgRNA包含一个或多个发夹区。在一些实施方案中，发夹区在连接区下游例如相对于其为3’。在一些实施方案中，将紧邻连接区下游的核苷酸的区称为“发夹1区”或“H1”。在一些实施方案中，将相对于发夹1为3’核苷酸的区称为“发夹2区”或“H2”。在一些实施方案中，发夹区包含发夹1区及发夹2区。在一些实施方案中，sgRNA仅包含发夹1区或发夹2区。在一些实施方案中，发夹1区包含12个紧邻连接区下游的核酸。在一些实施方案中，发夹1区包含如表1及图21A中所示的核苷酸H1-1至H1-12。在一些实施方案中，发夹2区包含15个发夹1区下游的核酸。在一些实施方案中，发夹2区包含如表1及图21A中所示的核苷酸H2-1至H2-15。在一些实施方案中，一个或多个核苷酸存在于发夹1区与发夹2区之间。发夹1区与发夹2区之间的一个或多个核苷酸可经修饰或未经修饰。在一些实施方案中，发夹1区与发夹2区通过一个核苷酸分离。在一些实施方案中，发夹区包含比表1及图21A中所示出少的核苷酸。在一些实施方案中，发夹区包含比表1及图21A中所示出多的核苷酸。当发夹区包含比表1及图21A的示意图中所示出少或多的核苷酸时，应维持如本领域技术人员显而易见的修饰模式。在一些实施方案中，当以相反方向读取时，发夹区具有核酸序列互补的核苷酸。在一些实施方案中，当以相反方向读取时，发夹区可不彼此完全互补例如发夹区的顶部或环包含不成对核苷酸。在一些实施方案中，sgRNA包含经核苷酸“n”取代发夹1区，其中“n”为1与50、40、30、20、15、10、5、4、3及2之间的整数。在一些实施方案中，sgRNA的发夹1区经2个核苷酸取代。g3’末端区在一些实施方案中，sgRNA包含发夹区之后的核苷酸。在一些实施方案中，3’末端区包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个核苷酸或超过20个核苷酸，例如不与发夹区的二级结构结合。在一些实施方案中，3’末端区包含1、2、3或4个不与发夹区的二级结构结合的核苷酸。在一些实施方案中，3’末端区包含4个不与发夹区的二级结构结合的核苷酸。在一些实施方案中，3’末端区包含1、2或3个不与发夹区的二级结构结合的核苷酸。2.sgRNA的修饰在一些实施方案中，本发明包含sgRNA，其包含以下区中的一个或多个中的一个或多个修饰：5’末端处的核苷酸；下部茎区；突起区；上部茎区；连接区；发夹1区；发夹2区；及3’末端处的核苷酸。在一些实施方案中，修饰包含2'-O-甲基2'-O-Me修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰包含2’-O-2-甲氧基乙基2’-O-moe修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰包含2’-氟2’-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰包含核苷酸之间的硫代磷酸酯PS键。在一些实施方案中，sgRNA包含其5’端处的前4个核苷酸中的1、2、3或4个处的修饰。在一些实施方案中，5’末端处的前三个或四个核苷酸，及3’末端处的最后三个或四个核苷酸经修饰。在一些实施方案中，5’末端处的前四个核苷酸，及3’末端处的最后四个核苷酸与硫代磷酸酯PS键连接。在一些实施方案中，修饰包含2’-O-Me。在一些实施方案中，修饰包含2’-F。在一些实施方案中，修饰包含2’-O-moe。在一些实施方案中，sgRNA包含5’端处的前4个核苷酸中的1、2、3或4个处的修饰。在一些实施方案中，sgRNA包含3’端处的前4个核苷酸中的1、2、3或4个处的修饰。在一些实施方案中，5’末端处的前四个核苷酸及3’末端处的最后四个核苷酸与PS键连接，且5’末端处的前三个核苷酸及3’末端处的最后三个核苷酸包含2'-O-Me或2'-O-moe修饰。在一些实施方案中，5’末端处的前四个核苷酸及3’末端处的最后四个核苷酸与PS键连接，且5’末端处的前三个核苷酸及3’末端处的最后三个核苷酸包含2'-F修饰。在一些实施方案中，提供sgRNA，其中LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12经2'-O-Me修饰。在一些实施方案中，sgRNA的突起区中的核苷酸中的每一个经2'-O-Me修饰。在一些实施方案中，sgRNA的上部茎区中的核苷酸中的每一个经2'-O-Me修饰。在一些实施方案中，sgRNA的连接区中的N16、N17及N18经2'-O-Me修饰。在一些实施方案中，sgRNA的发夹1区中的核苷酸中的每一个经2'-O-Me修饰。在一些实施方案中，sgRNA的发夹2区中的核苷酸中的每一个经2'-O-Me修饰。在一些实施方案中，sgRNA包含以下核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸：5’末端处的前三个核苷酸；LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12；突起区中的B1及B2；sgRNA的上部茎区中的核苷酸中的每一个；连接区中的N16、N17及N18；发夹1区中的核苷酸中的每一个；发夹2区中的核苷酸中的每一个；及3’末端处的最后四个核苷酸。在一些实施方案中，sgRNA进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，sgRNA进一步包含5’末端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me或2’-F修饰的核酸，及3’末端处的最后四个核苷酸处的2'-O-Me或2'-F修饰的核酸。在一些实施方案中，LS9及LS10经2’-F修饰。在一些实施方案中，N15、N16、N17及N18经2'-F修饰。在一些实施方案中，H2-9、H2-10、H2-11、H2-12、H2-13、HS-14及H2-15经2'-F修饰。在一些实施方案中，3’末端处的倒数第二个、倒数第三个及倒数第四个核苷酸经2’-F修饰。在一些实施方案中，提供包含以下核苷酸处的2'-F修饰的核酸的单指导RNAsgRNA：下部茎区中的LS9及LS10；连接区中的N15、N16、N17及N18；以及发夹2区中的H2-9、H2-10、H2-11、H2-12、H2-13、HS-14及H2-15。在一些实施方案中，sgRNA进一步包含3’末端处的倒数第二个、倒数第三个及倒数第四个核苷酸处的2'-F修饰核苷酸。在一些实施方案中，sgRNA进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，sgRNA进一步包含5’末端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me或2’-F修饰的核酸，及3’末端处的最后四个核苷酸中的三个处的2’-O-Me或2’-F修饰的核酸。在一些实施方案中，提供单指导RNAsgRNA，其包含5’末端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸；LS1及LS6处的2’-O-Me修饰核苷酸；US1至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；H1-1至H1-12处的2'-O-Me修饰核苷酸；发夹1区与发夹2区之间的2'-O-Me修饰核苷酸；H2-1至H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；及3’末端处的最后四个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸。在一些实施方案中，sgRNA进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，提供单指导RNAsgRNA，其包含5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；LS1至LS6处的2'-F修饰核苷酸；US1至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；发夹1区与发夹2区之间的“n”处的2'-O-Me修饰核苷酸；H2-1至H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；及3’末端处的最后四个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸。在一些实施方案中，sgRNA进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，提供单指导RNAsgRNA，其包含5’末端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸；LS2至LS5处的2’-F修饰核苷酸；LS1及LS6处的2’-O-Me修饰核苷酸；US1至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；发夹1区与发夹2区之间的“n”处的2'-O-Me修饰核苷酸；H2-1至H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；及3’末端处的最后四个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸。在一些实施方案中，sgRNA进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，提供单指导RNAsgRNA，其包含5’末端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸；US1至US12处的2'-O-Me修饰核苷酸；LS7、LS8、LS11及LS12处的2'-O-Me修饰核苷酸；H1-1至H1-12处的2'-O-Me修饰核苷酸；发夹1区与发夹2区之间的“n”处的2'-O-Me修饰核苷酸；H2-1至H2-15处的2'-O-Me修饰核苷酸；及3’末端处的最后四个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸。在一些实施方案中，sgRNA进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，提供单指导RNAsgRNA，其包含5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；US1至US12处的2'-O-Me修饰核苷酸；LS8、LS10及LS12处的2'-O-Me修饰核苷酸；LS7、LS9及LS11处的2'-O-F修饰的核苷酸；H1-1至H1-12处的2'-O-Me修饰核苷酸；发夹1区与发夹2区之间的2’-O-Me修饰核苷酸；H2-1至H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；及3’末端处的最后四个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸。在一些实施方案中，sgRNA进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，提供单指导RNAsgRNA，其包含5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12处的2’-O-Me修饰核苷酸；US1至US12处的2'-O-Me修饰核苷酸；H1-1至H1-12处的2'-O-Me修饰核苷酸；发夹1区与发夹2区之间的2'-O-Me修饰核苷酸；H2-1至H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；及3’末端处的最后四个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸。在一些实施方案中，sgRNA进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，提供单指导RNAsgRNA，其包含5’末端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸；LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12处的2’-O-Me修饰核苷酸；LS9及LS10处的2’-F修饰核苷酸；US1至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；发夹1区与发夹2区之间的2’-O-Me修饰核苷酸；H2-1至H2-15处的2'-O-Me修饰核苷酸；及3’末端处的最后四个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸。在一些实施方案中，sgRNA进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，提供单指导RNAsgRNA，其包含5’末端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸；US1至US12处的2'-O-Me修饰核苷酸；H1-1至H1-12处的2'-O-Me修饰核苷酸；发夹1区与发夹2区之间的2’-O-Me修饰核苷酸；H2-1至H2-8处的2'-O-Me修饰核苷酸；H2-9至H2-15处的2'-F修饰核苷酸；3’末端处的倒数第二个、倒数第三个及倒数第四个核苷酸处的2'-F修饰核苷酸；及3’末端处的最后一个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸。在一些实施方案中，sgRNA进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，提供单指导RNAsgRNA，其包含5’末端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸；US1至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；H1-2、H1-4、H1-6、H1-8、H1-10及H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；H1-1、H1-3、H1-5、H1-7、H1-9及H1-11处的2'-F修饰核苷酸；发夹1区与发夹2区之间的2'-F修饰核苷酸；H2-2、H2-4、H2-6、H2-8、H2-10、H2-12及H2-14处的2'-F修饰核苷酸；H2-1、H2-3、H2-5、H2-7、H2-9、H2-11、H2-13及H2-15处的2'-O-Me修饰核苷酸；3’末端处的倒数第二个及倒数第四个核苷酸处的2'-F修饰核苷酸；及3’末端处的倒数第三个及最后一个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸。在一些实施方案中，sgRNA进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，本文公开单指导RNAsgRNA，其包含核苷酸LS8、LS10、LS12、H1-2、H1-4、H1-6、H1-8、H1-10、H1-12、H2-1、H2-3、H2-5、H2-7、H2-9、H2-11、H2-13及H2-15处的2'-O-Me修饰；及LS7、LS9、LS11；H1-1、H1-3、H1-5、H1-7、H1-9、H1-11、H1-13、H2-2、H2-4、H2-6、H2-8、H2-10、H2-12及H2-14处的2'-F修饰。在一些实施方案中，sgRNA进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，sgRNA进一步包含3’末端处的最后一个及倒数第三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；及3’末端处的倒数第二个及倒数第三个核苷酸处的2'-F修饰核苷酸。在一些实施方案中，本文公开包含SEQIDNo：228至232中任一个的核酸的sgRNA。在一些实施方案中，本文公开包含SEQIDNo：235至240、265至285及309至329中任一个的核酸的sgRNA。在一些实施方案中，本文公开sgRNA，其包含与SEQIDNo：235至240、265至285及309至329中任一个的核酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70％同一性的核酸，其中修饰模式与参考序列标识符中示出的修饰模式相同。在一些实施方案中，sgRNA进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，提供sgRNA，其包含5’端修饰及以下一个或多个中的一个或多个修饰：上部茎区；发夹1区；及发夹2区，其中5’端修饰包含5’末端之前七个核苷酸内的至少两个硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，提供sgRNA，其包含5’端修饰及以下一个或多个中的一个或多个修饰：上部茎区；发夹1区；及发夹2区，其中5’端修饰包含RNA的5’端处的一个或多个硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，一个或多个硫代磷酸酯键连接5’末端核苷酸。在一些实施方案中，提供sgRNA，其包含5’端修饰及以下一个或多个中的一个或多个修饰：上部茎区；发夹1区；及发夹2区，其中5’端修饰包含5’末端之前七个核苷酸内的一个或多个硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，提供sgRNA，其包含SEQIDNo：228至332的经修饰sgRNA序列中任一个。在一些实施方案中，提供sgRNA，其包含或由SEQIDNo：235至240、265至285及309至329的经修饰sgRNA序列中任一个组成。在一些实施方案中，本发明包含sgRNA，其包含SEQIDNo：235至240、265至285及309至329的经修饰序列中任一个，其中sgRNA进一步包含与靶序列至少部分互补的5’间隔序列，且将Cas9引导至其标靶以进行切割。在一些实施方案中，本发明包含sgRNA，其包含与SEQIDNo：235至240、265至285及309至329中任一个的核苷酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70％同一性的核苷酸，其中修饰模式与参考序列标识符中示出的修饰模式相同。也即，相比于序列中所示出的，核苷酸A、U、C及G可相差99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70％，但修饰保持不变。在一些实施方案中，本发明包含sgRNA，其包含以下区中的一个或多个中的一个或多个修饰：5’末端处的核苷酸；下部茎区；突起区；上部茎区；连接区；发夹1区；发夹2区；及3’末端处的核苷酸。在一些实施方案中，修饰包含2'-O-甲基2'-O-Me修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰包含2’-氟2'-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰包含核苷酸之间的硫代磷酸酯PS键。在一些实施方案中，修饰包含反向无碱基核苷酸。在一些实施方案中，提供sgRNA，其包含以下处的2’-O-Me修饰核苷酸：5’末端区中之前三个核苷酸；下部茎区中的LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12；突起区中的B1及B2；上部茎区中的核苷酸中的每一个；连接区中的N16、N17及N18；发夹1区中的核苷酸中的每一个；发夹1区与发夹2区之间的一个核苷酸；发夹2区中的核苷酸中的每一个；及3’末端处的最后四个核苷酸。在一个实施方案中，sgRNA进一步包含5’末端处的前四个核苷酸之间的三个PS键及3’末端处的最后四个核苷酸之间的三个PS键。在一些实施方案中，提供sgRNA，其包含以下处的2’-O-Me修饰核苷酸：5’末端区中之前三个核苷酸；下部茎区中的LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12；突起区中的B1至B6；上部茎区中的核苷酸中的每一个；连接区中的N16、N17及N18；发夹1区中的核苷酸中的每一个；发夹1区与发夹2区之间的一个核苷酸；发夹2区中的核苷酸中的每一个；及3’末端处的最后四个核苷酸。在一个实施方案中，sgRNA进一步包含5’末端处的前四个核苷酸之间的三个PS键及3’末端处的最后四个核苷酸之间的三个PS键。在一些实施方案中，提供sgRNA，其包含以下处的2'-F修饰核苷酸：下部茎区中的LS9及LS10；连接区中的15-N18；发夹2区中的H2-9至HS-15；及3’末端区中的倒数第二个、倒数第三个及倒数第四个核苷酸。在一些实施方案中，提供sgRNA，其包含以下处的2'-F修饰核苷酸：下部茎区中的各核苷酸；连接区中的15-N18；发夹2区中的H2-9至HS-15；及3’末端区中的倒数第二个、倒数第三个及倒数第四个核苷酸。在一些实施方案中，提供单指导RNAsgRNA，其包含LS8、LS10、LS12、H1-2、H1-4、H1-6、H1-8、H1-10、H1-12、H2-1、H2-3、H2-5、H2-7、H2-9、H2-11、H2-13、H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸，及3’末端的最后一个及倒数第三个核苷酸；以及LS7、LS9、LS11；H1-1、H1-3、H1-5、H1-7、H1-9、H1-11、H1-13、H2-2、H2-4、H2-6、H2-8、H2-10、H2-12、H2-14处的2’-F修饰，及3’末端处的倒数第二个及倒数第四个核苷酸。本发明涵盖以下实施方案中的每一个：实施方案01.一种单指导RNAsgRNA，其包含以下区中的一个或多个中的一个或多个修饰：a.5’末端；b.下部茎区；c.突起区；d.上部茎区；e.连接区；f.发夹1区；g.发夹2区；及h.3’末端。实施方案02.如实施方案1的sgRNA，其中该修饰包含2’-O-甲基2’-O-Me修饰的核苷酸。实施方案03.如实施方案1的sgRNA，其中该修饰包含2’-氟2’-F修饰的核苷酸。实施方案04.如实施方案1的sgRNA，其中该修饰包含核苷酸之间的硫代磷酸酯PS键。实施方案05.如实施方案1至3中任一项的sgRNA，其中5’末端处的前三个或四个核苷酸，及3’末端处的最后三个或四个核苷酸经修饰。实施方案06.如实施方案1至5中任一项的sgRNA，其中5’末端处的前四个核苷酸，及3’末端处的最后四个核苷酸与硫代磷酸酯PS键连接。实施方案07.如实施方案5的sgRNA，其中该修饰包含2'-O-Me。实施方案08.如实施方案5的sgRNA，其中该修饰包含2'-F。实施方案09.如实施方案1至7中任一项的sgRNA，其中5’末端处的前四个核苷酸及3’末端处的最后四个核苷酸与PS键连接，且其中5’末端处的前三个核苷酸及3’末端处的最后三个核苷酸包含2'-O-Me修饰。实施方案10.如实施方案1至8中任一项的sgRNA，其中5’末端处的前四个核苷酸及3’末端处的最后四个核苷酸与PS键连接，且其中5’末端处的前三个核苷酸及3’末端处的最后三个核苷酸包含2'-F修饰。实施方案11.如实施方案1至10中任一项的sgRNA，其中LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12经2’-O-Me修饰。实施方案12.如实施方案1至11中任一项的sgRNA，其中突起区中的核苷酸中的每一个经2’-O-Me修饰。实施方案13.如实施方案1至12中任一项的sgRNA，其中上部茎区中的核苷酸中的每一个经2’-O-Me修饰。实施方案14.如实施方案1至13中任一项的sgRNA，其中连接区中的N16、N17及N18经2’-O-Me修饰。实施方案15.如实施方案1至14中任一项的sgRNA，其中发夹1区中的核苷酸中的每一个经2’-O-Me修饰。实施方案16.如实施方案1至15中任一项的sgRNA，其中发夹2区中的核苷酸中的每一个经2’-O-Me修饰。实施方案17.一种单指导RNAsgRNA，其包含以下核苷酸处的2’-O-Me修饰的核酸：a.5’末端处的前三个核苷酸；b.下部茎区中的LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12；c.突起区中的B1及B2；d.上部茎区中的各核苷酸；e.连接区中的N16、N17及N18；f.发夹1区中的各核苷酸；g.发夹2区中的各核苷酸；及h.3’末端处的最后四个核苷酸。实施方案18.如实施方案17的sgRNA，其中B3至B6经2'-O-Me修饰。实施方案19.如实施方案17的sgRNA，其进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。实施方案20.如实施方案1至10中任一项的sgRNA，其中LS9及LS10经2'-F修饰。实施方案21.如实施方案1至10及20中任一项的sgRNA，其中N15、N16、N17及N18经2’-F修饰。实施方案22.如实施方案1至10及20至21中任一项的sgRNA，其中H2-9、H2-10、H2-11、H2-12、H2-13、H2-14及H2-15经2'-F修饰。实施方案23.如实施方案1至10及21至22中任一项的sgRNA，其中3’末端处的倒数第二个、倒数第三个及倒数第四个核苷酸经2’-F修饰。实施方案24.一种单指导RNAsgRNA，其包含以下位置处的2’-F修饰核苷酸：a.下部茎区中的LS9及LS10；b.连接区中的N15、N16、N17及N18；及c.发夹2区中的H2-9、H2-10、H2-11、H2-12、H2-13、H2-14及H2-15。实施方案25.如实施方案24的sgRNA，其进一步包含3’末端处的倒数第二个、倒数第三个及倒数第四个核苷酸处的2’-F修饰核苷酸。实施方案26.如实施方案24或25中任一项的sgRNA，其进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。实施方案27.如实施方案24至26中任一项的sgRNA，其进一步包含5’末端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me或2'-F修饰核苷酸，及3’末端处的最后四个核苷酸中的三个处的2'-O-Me或2’-F修饰核苷酸。实施方案28.一种单指导RNAsgRNA，其包含a.5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；b.LS1及LS6处的2'-O-Me修饰核苷酸；c.US1至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；d.H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；e.发夹1区与发夹2区之间的2’-O-Me修饰核苷酸；f.H2-1至H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；及g.3’末端处的最后四个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸。实施方案29.如实施方案28的sgRNA，其进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。实施方案30.一种单指导RNAsgRNA，其包含a.5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；b.LS1至LS6处的2’-F修饰核苷酸；c.US1至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；d.H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；e.发夹1区与发夹2区之间的2'-O-Me修饰核苷酸；f.H2-1至H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；及g.3’末端处的最后四个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸。实施方案31.如实施方案30的sgRNA，其进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。实施方案32.一种单指导RNAsgRNA，其包含a.5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；b.LS2至LS5处的2'-F修饰核苷酸；c.LS1及LS6处的2'-O-Me修饰核苷酸；d.US1至US12处的2'-O-Me修饰核苷酸；e.H1-1至H1-12处的2'-O-Me修饰核苷酸；f.发夹1区与发夹2区之间的2'-O-Me修饰核苷酸；g.H2-1至H2-15处的2'-O-Me修饰核苷酸；及h.3’末端处的最后四个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸。实施方案33.如实施方案32的sgRNA，其进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。实施方案34.一种单指导RNAsgRNA，其包含a.5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；b.US1至US12处的2'-O-Me修饰核苷酸；c.LS7、LS8、LS11及LS12处的2’-O-Me修饰核苷酸；d.H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；e.发夹1区与发夹2区之间的2’-O-Me修饰核苷酸；f.H2-1至H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；及g.3’末端处的最后四个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸。实施方案35.如实施方案34的sgRNA，其进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。实施方案36.一种单指导RNAsgRNA，其包含a.5’末端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸；b.US1至US12处的2'-O-Me修饰核苷酸；c.LS7、LS8、LS11及LS12处的2’-O-Me修饰核苷酸；d.LS9及LS10处的2’-F修饰核苷酸；e.H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；f.发夹1区与发夹2区之间的2’-O-Me修饰核苷酸；g.H2-1至H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；及h.3’末端处的最后四个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸。实施方案37.如实施方案36的sgRNA，其进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。实施方案38.一种单指导RNAsgRNA，其包含a.5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；b.US1至US12处的2'-O-Me修饰核苷酸；c.LS8、LS10及LS12处的2’-O-Me修饰核苷酸；d.LS7、LS9及LS11处的2’-O-F修饰的核苷酸；e.H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；f.发夹1区与发夹2区之间的2'-O-Me修饰核苷酸；g.H2-1至H2-15处的2'-O-Me修饰核苷酸；及h.3’末端处的最后四个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸。实施方案39.如实施方案32的sgRNA，其进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。实施方案40.一种单指导RNAsgRNA，其包含a.5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；b.LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12处的2'-O-Me修饰核苷酸c.US1至US12处的2'-O-Me修饰核苷酸；d.H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；e.发夹1区与发夹2区之间的2'-O-Me修饰核苷酸；f.H2-1至H2-15处的2'-O-Me修饰核苷酸；及g.3’末端处的最后四个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸。实施方案41.如实施方案40的sgRNA，其进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。实施方案42.一种单指导RNAsgRNA，其包含a.5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；b.LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12处的2’-O-Me修饰核苷酸；c.LS9及LS10处的2'-F修饰核苷酸；d.US1至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；e.H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；f.发夹1区与发夹2区之间的2’-O-Me修饰核苷酸；g.H2-1至H2-15处的2'-O-Me修饰核苷酸；及h.3’末端处的最后四个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸。实施方案43.如实施方案43的sgRNA，其进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。实施方案44.一种单指导RNAsgRNA，其包含a.5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；b.US1至US12处的2'-O-Me修饰核苷酸；c.H1-1至H1-12处的2'-O-Me修饰核苷酸；d.发夹1区与发夹2区之间的2'-O-Me修饰核苷酸；e.H2-1至H2-8处的2'-O-Me修饰核苷酸；f.H2-9至H2-15处的2'-F修饰核苷酸；g.3’末端处的倒数第二个、倒数第三个及倒数第四个核苷酸处的2'-F修饰核苷酸；及h.3’末端处的最后一个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸。实施方案45.如实施方案44的sgRNA，其进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。实施方案46.一种单指导RNAsgRNA，其包含a.5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；b.US1至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；c.H1-2、H1-4、H1-6、H1-8、H1-10及H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；d.H1-1、H1-3、H1-5、H1-7、H1-9及H1-11处的2’-F修饰核苷酸；e.发夹1区与发夹2区之间的2’-F修饰核苷酸；f.H2-2、H2-4、H2-6、H2-8、H2-10、H2-12及H2-14处的2’-F修饰核苷酸；g.H2-1、H2-3、H2-5、H2-7、H2-9、H2-11、H2-13及H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；h.3’末端处的倒数第二个及倒数第四个核苷酸处的2'-F修饰核苷酸；及i.3’末端处的倒数第三个及最后一个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸。实施方案47.如实施方案46的sgRNA，其进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。实施方案48.一种单指导RNAsgRNA，其包含a.LS8、LS10、LS12、H1-2、H1-4、H1-6、H1-8、H1-10、H1-12、H2-1、H2-3、H2-5、H2-7、H2-9、H2-11、H2-13及H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；及b.LS7、LS9、LS11；H1-1、H1-3、H1-5、H1-7、H1-9、H1-11、H1-13、H2-2、H2-4、H2-6、H2-8、H2-10、H2-12及H2-14处的2’-F修饰核苷酸。实施方案49.如实施方案48的sgRNA，其进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。实施方案50.如实施方案48至49中任一项的sgRNA，其进一步包含a.3’末端处的最后一个及倒数第三个核苷酸处的2'-O-Me修饰核苷酸；及b.3’末端处的倒数第二个及倒数第三个核苷酸处的2'-F修饰核苷酸。实施方案51.一种sgRNA，其包含SEQIDNo：228至332中任一个的核酸。实施方案52.一种sgRNA，其包含SEQIDNo：235至240、265至285及309至329中任一个的核酸。实施方案53.一种sgRNA，其包含与SEQIDNo：235至240、265至285及309至329中任一个的核酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70％同一性的核酸，其中修饰模式与参考序列标识符中示出的修饰模式相同。实施方案54.如实施方案51至53中任一项的sgRNA，其进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。B.dgRNA的组合物在一些实施方案中，本发明的组合物及方法包含gRNA，其包含将诸如Cas9的核酸酶引导至标靶DNA序列的crRNA及trRNA。在一些实施方案中，gRNA却结合在两个独立RNA分子上双指导RNA或dgRNA。表2及图21C提供如本文所用的crRNA的结构域的描述。5’末端区可包含crRNA的5’末端处或附近的间隔区且用以将Cas9引导至DNA中的靶区结构域，例如如本文所述。在表2中，区之间的“n”表示核苷酸的可变数目，例如0到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大。在一些实施方案中，n等于0。本文所述的dgRNA中任一个可包括任何结构域之间的“n”。表3及图21C提供如本文所用的trRNA的结构域的描述。在表3中，区之间的“n”表示核苷酸的可变数目，例如0到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大。在一些实施方案中，n等于0。本文所述的dgRNA中任一个可包括任何结构域之间的“n”。1.dgRNA的结构域如Briner2014中所述，dgRNA可基于在本文中称为“结构域”的特定功能性结构域，包括负责定向的间隔结构域、下部茎、突起、上部茎、连接及发夹结构域开发。在dgRNA中，crRNA包含gRNA的一些组分且trRNA包含gRNA的一些组分。crRNA的区提供于表2及图21C中。trRNA的区提供于表3及图21C中。图21C显示例示性dgRNA的示意图。表2：crRNA的区线性查看，5′至3′LS1-6B1-2US1-145′末端区n下部茎区n隆突区n上部茎区3′末端区表3：trRNA的区线性查看，5′至3′US1-11B1-4LS1-6N1-18H1-1至H1-12H2-1至H2-155′末端区n上部茎区n隆突区n下部茎区n连接区n发夹1区n发夹2区3′末端区a5’末端区在一些实施方案中，dgRNA包含如表2-3及图21C中所示的crRNA及trRNA的5’末端处的核苷酸。在一些实施方案中，crRNA的5’末端包含用以将Cas蛋白质引导至标靶核苷酸序列的间隔区或指导区。在一些实施方案中，5’末端不包含间隔区或指导区。在一些实施方案中，5’末端包含间隔子及不用以将Cas蛋白质引导至靶核苷酸区的额外核苷酸。在一些实施方案中，指导区包含crRNA的5’端之前1至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方案中，指导区包含20个核苷酸。在一些实施方案中，指导区可包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或超过25个核苷酸。在一些实施方案中，指导区可包含17个核苷酸。在一些实施方案中，指导区可包含18个核苷酸。在一些实施方案中，指导区可包含19个核苷酸。在一些实施方案中，指导区的选择是基于用于编辑的目的基因内的靶序列而判定。举例而言，在一些实施方案中，crRNA包含与目的基因的靶序列互补的指导区。在一些实施方案中，目的基因中的靶序列可与crRNA的指导区互补。在一些实施方案中，crRNA的指导区与目的基因中的其对应靶序列之间的互补性或同一性程度可为约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，crRNA的指导区与目的基因的靶区结构域可100％互补或一致。在其他实施方案中，crRNA的指导区及目的基因的靶区结构域可含有至少一个错配。举例而言，crRNA的指导区及目的基因的靶序列可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个错配，其中靶序列的总长度为至少约17、18、19、20或超过20个碱基对。在一些实施方案中，crRNA的指导区及目的基因的靶区结构域可含有1至6个错配，其中指导序列包含至少约17、18、19、20或超过20个核苷酸。在一些实施方案中，crRNA的指导区及目的基因的靶区结构域可含有1、2、3、4、5或6个错配，其中指导序列包含约20个核苷酸。在一些实施方案中，trRNA包含5’末端区。在一些实施方案中，trRNA包含部分形成dgRNA的上部茎区的5’末端区。trRNA的5’末端区不与靶基因的区互补。b下部茎区在一些实施方案中，dgRNA包含下部茎LS区。下部茎区包含如图21C中所示地结合的crRNA下部茎区及trRNA下部茎区。在一些实施方案中，crRNA的下部茎区与trRNA的下部茎区至少部分互补。在一些实施方案中，crRNA的下部茎区与trRNA的下部茎区完全互补。在一些实施方案中，crRNA及trRNA的下部茎区各自包含6个核苷酸。在一些实施方案中，crRNA及trRNA的下部茎区各自包含比表2-3及图21C中所示出少的核苷酸。在一些实施方案中，下部茎区包含比表2-3及图21C中所示出多的核苷酸。当下部茎区包含比表2-3及图21C的示意图中所示出少或多的核苷酸时，维持本领域技术人员显而易见的修饰模式。在一些实施方案中，crRNA的下部茎区中的核苷酸的数目不同于trRNA的下部茎区中的核苷酸的数目。c突起区在一些实施方案中，dgRNA包含突起B区。在一些实施方案中，crRNA包含一个突起区且trRNA包含一个突起区。在一些实施方案中，各突起区包含1至4个核苷酸。在一些实施方案中，crRNA的突起区包含两个核苷酸，且trRNA的突起区包含四个核苷酸。在一些实施方案中，crRNA突起区位于crRNA的下部茎区与上部茎区之间。在一些实施方案中，crRNA的突起区包含两个核苷酸。在一些实施方案中，crRNA的突起区包含如表2及图21C所示的核苷酸B1及B2。在一些实施方案中，trRNA突起区位于trRNA的上部茎区与下部茎区之间。在一些实施方案中，trRNA的突起区包含四个核苷酸。在一些实施方案中，trRNA的突起区包含如表3及图21C所示的核苷酸B1至B4。在一些实施方案中，突起区的存在导致dgRNA中的上部与下部茎模块之间的定向扭结。crRNA突起区及trRNA突起区可部分互补。crRNA突起区及trRNA突起区可不互补。在一些实施方案中，crRNA及trRNA的突起区包含比表2-3及图21C中所示出多的核苷酸。当突起区包含比表2-3及图21C的示意图中所示出少或多的核苷酸时，维持本领域技术人员显而易见的修饰模式。在一些实施方案中，crRNA的突起区中的核苷酸的数目不同于trRNA的突起区中的核苷酸的数目。d上部茎区在一些实施方案中，dgRNA包含上部茎US区。上部茎区包含如图21C中所示地结合的crRNA上部茎区及trRNA上部茎区。在一些实施方案中，crRNA的上部茎区与trRNA的上部茎区至少部分互补。在一些实施方案中，crRNA的上部茎区与trRNA的上部茎区完全互补。在一些实施方案中，crRNA的上部茎区包含十四个核苷酸。在一些实施方案中，trRNA的上部茎区包含十一个核苷酸。在一些实施方案中，crRNA及trRNA的上部茎区各自包含比表2-3及图21C中所示出少的核苷酸。在一些实施方案中，crRNA及trRNA的上部茎区包含比表2-3及图21C中所示出多的核苷酸。当上部茎区包含比表2-3及图21C的示意图中所示出少或多的核苷酸时，维持本领域技术人员显而易见的修饰模式。在一些实施方案中，crRNA的上部茎包含如表2及图21C中所示的核苷酸US1至US14。在一些实施方案中，trRNA的上部茎包含如表3及图21C中所示的核苷酸US1至US11。e连接区在一些实施方案中，dgRNA包含含有连接区的trRNA。在一些实施方案中，连接区在trRNA的下部茎区与发夹1区之间。在一些实施方案中，连接区紧邻地位于trRNA的下部茎区下游。在一些实施方案中，连接区包含十八个核苷酸。在一些实施方案中，trRNA的连接区包含如表3及图21C所示的核苷酸N1至N18。在一些实施方案中，连接区包含比表3及图21C中所示出少的核苷酸。在一些实施方案中，trRNA的连接区包含比表3及图21C中所示出多的核苷酸。当连接区包含比3及图21C中所示出少或多的核苷酸时，维持本领域技术人员显而易见的修饰模式。在一些实施方案中，当以相反方向读取时，连接区具有核酸序列互补的核苷酸。在一些实施方案中，核酸序列中的互补性产生sgRNA中的茎及或茎环的二级结构例如连接区中的某些核苷酸可彼此碱基配对。在一些实施方案中，当以相反方向读取时，连接区可不彼此完全互补。f发夹区在一些实施方案中，trRNA的发夹区在连接区下游。在一些实施方案中，将紧邻连接区下游的核苷酸的区称为“发夹1区”。在一些实施方案中，将紧邻发夹1区下游的核苷酸的区称为“发夹2区”。在一些实施方案中，发夹区包含发夹1区及发夹2区。在一些情况下，发夹1区及发夹2区通过一个或多个核苷酸“n”分离。在一些实施方案中，n＝1。在一些实施方案中，trRNA仅包含发夹1区或发夹2区。已显示经2个核苷酸取代trRNA的发夹1区允许编辑CasRNP的活性参见US20150376586，图16。在一些实施方案中，trRNA包含经核苷酸“n”取代发夹1区，其中“n”为1与50、40、30、20、15、10、5、4、3及2之间的整数。在一些实施方案中，trRNA的发夹1区经2个核苷酸取代。在一些实施方案中，trRNA的发夹1区包含十二个紧邻连接区下游的核苷酸。在一些实施方案中，trRNA的发夹1区包含如表3及图21C中所示的核苷酸H1-1至H1-12。在一些实施方案中，非发夹核苷酸存在于trRNA的发夹1区与发夹2区之间。在一些实施方案中，一至两个非发夹核苷酸存在于发夹1区与发夹2区之间。在一些实施方案中，trRNA的发夹2区包含十五个在发夹1之后相对于其为3’的核苷酸。在一些实施方案中，trRNA的发夹2区包含如表3及图21C中所示的核苷酸H2-1至H2-15。在一些实施方案中，trRNA的发夹2区包含如表3中所示的核苷酸H2-1至H2-15，且发夹1区与发夹2区之间的“n”为1或2。在一些实施方案中，trRNA的发夹区包含比表3及图21C中所示出多的核苷酸。当发夹区包含比表3及图21C中所示出少或多的核苷酸时，维持本领域技术人员显而易见的修饰模式。在一些实施方案中，当以相反方向读取时，发夹区具有核酸序列互补的核苷酸。在一些实施方案中，当以相反方向读取时，发夹区可不彼此完全互补例如发夹区的顶部或环包含不成对核苷酸。在一些实施方案中，trRNA包含经核苷酸“n”取代发夹1区，其中“n”为1与50、40、30、20、15、10、5、4、3及2之间的整数。在一些实施方案中，trRNA的发夹1区经2个核苷酸取代。g3’末端区在一些实施方案中，dgRNA包含含有3’末端区的trRNA，该3’末端区在发夹区之后相对于其为3’包含额外核苷酸。在一些实施方案中，3’末端区包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个或超过20个不与发夹区的二级结构结合的核苷酸。在一些实施方案中，3’末端区包含1、2、3或4个不与发夹区的二级结构结合的核苷酸。在一些实施方案中，3’末端区包含4个不与发夹区的二级结构结合的核苷酸。在一些实施方案中，3’末端区包含1、2或3个不与发夹区的二级结构结合的核苷酸。2.dgRNA的修饰在一些实施方案中，dgRNA包含经修饰的crRNA及未经修饰的trRNA。在一些实施方案中，dgRNA包含未经修饰的crRNA及经修饰的trRNA。在一些实施方案中，dgRNA的crRNA及trRNA均包含修饰。在一些实施方案中，本文所述的gRNA在两个独立RNA分子上双指导RNA或dgRNA。参见表2、3及图21C。在一些实施方案中，本发明包含dgRNA，其包含或由以下者组成：aSEQIDNo：1至187的crRNA序列中任一个；及bSEQIDNo：188至227中所述的trRNA序列中任一个。在一些实施方案中，提供包含1至187的经修饰crRNA序列中任一个的dgRNA。在一些实施方案中，提供包含188至227的经修饰trRNA序列中任一个的dgRNA。在一些实施方案中，提供包含SEQIDNo：19至31、53至73及104至130的经修饰crRNA序列中任一个的dgRNA。在一些实施方案中，本发明包含dgRNA，其包含SEQIDNo：19至31、53至73及104至130的经修饰序列中任一个，其中crRNA进一步包含与靶序列至少部分互补的5’间隔序列，且将Cas9引导至其标靶以进行切割。在一些实施方案中，本发明包含crRNA，其包含SEQIDNo：1至187中所述的序列中任一个。在一些实施方案中，本发明包含crRNA，其包含或由SEQIDNo：19至31、53至73及104至130中所述的序列中任一个组成。在一些实施方案中，本发明包含crRNA，其包含SEQIDNo：19至31、53至73及104至130中所述的序列中任一个及间隔区。在一些实施方案中，本发明包含trRNA，其包含或由SEQIDNo：188至277中所述的序列中任一个组成。在一些实施方案中，本发明包含crRNA，其包含与SEQIDNo：1至187中任一个的核苷酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70％同一性的核苷酸，其中修饰模式与参考序列标识符中示出的修饰模式相同。也即，相比于序列中所示出的，核苷酸A、U、C及G可相差99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70％，但修饰保持不变。在一些实施方案中，本发明包含trRNA，其包含与SEQIDNo：188至277中任一个的核苷酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70％同一性的核苷酸，其中修饰模式与参考序列标识符中示出的修饰模式相同。也即，相比于序列中所示出的，核苷酸A、U、C及G可相差99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70％，但各核苷酸上的修饰保持不变。3.具有修饰的crRNA、trRNA及dgRNA在一些实施方案中，crRNA包含5’末端区、下部茎区、突起区、上部茎区及3’末端区中的一个或多个内的一个或多个经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰包含2’-O-Me。在一些实施方案中，修饰包含2'-F。在一些实施方案中，修饰包含连接一个或多个核苷酸的硫代磷酸酯PS键。在一些实施方案中，修饰为连接5’末端处的前四个核苷酸的三个PS键及连接3’末端处的最后四个核苷酸的三个PS键。在一些实施方案中，修饰包含反向无碱基核苷酸。在一些实施方案中，提供crRNA，其包含上部茎区中的各核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸。在一些实施方案中，crRNA的US-1至US-14各经2’-O-Me修饰。在一些实施方案中，crRNA的LS1及LS6经2’-O-Me修饰。在一些实施方案中，crRNA的LS5经2’-O-Me修饰。在一些实施方案中，提供crRNA，其包含上部茎区中的核苷酸中的每一个，及下部茎区中的LS1及LS6处的2'-O-Me修饰核苷酸。在一些实施方案中，crRNA进一步包含5’及或3’末端区中，例如5’及或3’端修饰中的一个或多个2’-O-Me或2’-O-moe修饰的核苷酸。在一些实施方案中，提供crRNA，其包含上部茎区中的核苷酸中的每一个、下部茎区中的LS1、LS5及LS6处的2’-O-Me修饰核苷酸。在一些实施方案中，crRNA进一步包含5’及或3’末端区中，例如5’及或3’端修饰中的一个或多个2’-O-Me或2'-O-moe修饰的核苷酸。在一些实施方案中，本发明包含crRNA，其包含下部茎区中的LS1、LS2及LS6处的2'-F修饰核苷酸。在一些实施方案中，crRNA进一步包含突起区中的B1及B2中的每一个处的2'-F修饰核苷酸。在一些实施方案中，本发明包含crRNA，其包含下部茎区中的LS1、LS2及LS6，及突起区中的B1及B2中的每一个处的2'-F修饰核苷酸。在一些实施方案中，crRNA进一步包含5’及或3’末端区中，例如5’及或3’端修饰中的一个或多个2'-O-Me或2'-O-moe修饰的核苷酸。在一些实施方案中，crRNA包含下部茎区中的核苷酸LS1及LS6；突起区中的核酸中的每一个；及上部茎区中的核酸中的每一个处的2’-O-Me修饰核苷酸。在一些实施方案中，crRNA的LS5核苷酸也经2’-O-Me修饰。在一些实施方案中，crRNA的LS2、LS3及LS4未经修饰。在一些实施方案中，crRNA进一步包含5’及或3’末端区中，例如5’及或3’端修饰中的一个或多个2’-O-Me或2’-O-moe修饰的核苷酸。在一些实施方案中，crRNA包含下部茎区中的LS1、LS2及LS6，及突起区中的核苷酸中的每一个处的2’-氟2'-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，crRNA包含下部茎区中的LS1、LS2及LS6处，及突起区中的B2及B2处的2’-氟2'-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，crRNA包含下部茎区中的LS1-LS6，及突起区中的核苷酸中的每一个处的2’-氟2'-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，crRNA进一步包含5’及或3’末端区中，例如5’及或3’端修饰中的一个或多个2’-O-Me或2’-O-moe修饰的核苷酸。在一些实施方案中，本发明包含trRNA，其包含以下区中的一个或多个内的一个或多个经修饰的核苷酸：5’末端区；上部茎区；突起区；下部茎区；连接区；发夹1区；发夹1区与发夹2区之间的中间区interventingregion；发夹2区；及3’末端区。在一些实施方案中，修饰包含2’-O-Me。在一些实施方案中，修饰包含2'-F。在一些实施方案中，修饰包含连接一个或多个核苷酸的硫代磷酸酯PS键。在一些实施方案中，修饰为连接5’末端处的前四个核苷酸的三个PS键及连接3’末端处的最后四个核苷酸的三个PS键。在一些实施方案中，修饰包含反向无碱基核苷酸。在一些实施方案中，trRNA包含以下各处的2’-O-Me修饰核苷酸：上部茎区中的各核酸；突起区中的B1及B2；下部茎区中的LS1及LS2；连接区中的N3、N4、N5、N15、N16、N17及N18；发夹1区中的各核苷酸；发夹1区与发夹2区之间的一个核苷酸；及发夹2区中的各核苷酸。在一些实施方案中，trRNA进一步包含5’及或3’末端区中，例如5’及或3’端修饰中的一个或多个2'-O-Me或2'-O-moe修饰的核苷酸。在一些实施方案中，trRNA包含以下各处的2’-O-Me修饰核苷酸：上部茎区中的各核酸；突起区中的各核苷酸；下部茎区中的LS1、LS2、LS5及LS6；连接区中的N3至N5、N10至N18；发夹1区中的各核苷酸；发夹1区与发夹2区之间的一个核苷酸；及发夹2区中的各核苷酸。在一些实施方案中，crRNA进一步包含5’及或3’末端区中，例如5’及或3’端修饰中的一个或多个2’-O-Me或2’-O-moe修饰的核苷酸。在一些实施方案中，trRNA包含连接区中的N15至N18处的2’-F修饰核苷酸。在一些实施方案中，trRNA进一步包含5’及或3’末端区中，例如5’及或3’端修饰中的一个或多个2’-F修饰核苷酸。在一些实施方案中，trRNA包含下部茎区中的LS4及LS5，及连接区中的N13至N18处的2'-F修饰核苷酸。在一些实施方案中，trRNA进一步包含5’及或3’末端区中，例如5’及或3’端修饰中的一个或多个2’-F修饰核苷酸。在一些实施方案中，trRNA包含下部茎区中的LS1、LS3及LS5处的2’-F修饰核苷酸，及下部茎区中的LS2、LS4及LS6处的2’-O-Me修饰核苷酸。在一些实施方案中，本文公开crisprRNAcrRNA，其包含以下区中的一个或多个中的一个或多个修饰：5’末端处的前五个核苷酸；下部茎区；突起区；上部茎区；及3’末端处的最后五个核苷酸。在一些实施方案中，修饰包含2’-O-甲基2’-O-Me修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰包含2’-氟2'-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰包含核苷酸之间的硫代磷酸酯PS键。在一些实施方案中，5’末端处的前三个核苷酸，及3’末端处的最后三个核苷酸经修饰。在一些实施方案中，5’末端处的前四个核苷酸，及3’末端处的最后四个核苷酸与硫代磷酸酯PS键连接。在一些实施方案中，修饰包含2'-O-Me。在一些实施方案中，修饰包含2'-F。在一些实施方案中，5’末端处的前四个核苷酸及3’末端处的最后四个核苷酸与PS键连接，且其中5’末端处的前三个核苷酸及3’末端处的最后三个核苷酸包含2’-O-Me修饰。在一些实施方案中，5’末端处的前四个核苷酸及3’末端处的最后四个核苷酸与PS键连接，且其中5’末端处的前三个核苷酸及3’末端处的最后三个核苷酸包含2’-F修饰。在一些实施方案中，LS1及LS6经2’-O-Me修饰。在一些实施方案中，上部茎区中的核苷酸中的每一个经2’-O-Me修饰。在一些实施方案中，本发明包含crisprRNAcrRNA，其包含以下核苷酸处的2’-O-Me修饰的核酸：下部茎区中的LS1及LS6；及上部茎区中的各核苷酸。在一些实施方案中，crRNA进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，crRNA进一步包含5’末端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me或2'-F修饰的核酸，及3’末端处的最后三个核苷酸处的2'-O-Me或2'-F修饰的核酸。在一些实施方案中，LS1、LS2及LS6经2'-F修饰。在一些实施方案中，突起区中的各核苷酸经2'-F修饰。在一些实施方案中，本文公开crisprRNAcrRNA，其包含以下核苷酸处的2'-F修饰的核酸：下部茎区中的LS1、LS2及LS6；及突起区中的各核苷酸。在一些实施方案中，crRNA进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，crRNA进一步包含5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me或2’-F修饰的核酸，及3’末端处的最后三个核苷酸处的2'-O-Me或2'-F修饰的核酸。在一些实施方案中，提供crRNA，其包含SEQIDNo：1至187中任一个的核酸。在一些实施方案中，提供crRNA，其包含SEQIDNo：19至31、53至73、104至130及161至187中任一个的核酸。在一些实施方案中，提供crRNA，其包含与SEQIDNo：19至31、53至73、104至130及161至187中任一个的核酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70％同一性的核酸，其中修饰模式与参考序列标识符中示出的修饰模式相同。在一些实施方案中，crRNA进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。本发明也涵盖tracrRNAtrRNA，其包含以下区中的一个或多个中的一个或多个修饰：5’末端处的前五个核苷酸；上部茎区；突起区；下部茎区；连接区；发夹1区；发夹2区；及3’末端处的最后五个核苷酸。在一些实施方案中，修饰包含2'-O-甲基2'-O-Me修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰包含2’-氟2'-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰包含核苷酸之间的硫代磷酸酯PS键。在一些实施方案中，5’末端处的前四个核苷酸，及3’末端处的最后四个核苷酸与硫代磷酸酯PS键连接。在一些实施方案中，5’末端处的前三个核苷酸，及3’末端处的最后三个核苷酸经修饰。在一些实施方案中，修饰包含2'-O-Me。在一些实施方案中，修饰包含2’-F。在一些实施方案中，5’末端处的前四个核苷酸及3’末端处的最后四个核苷酸与PS键连接，且其中5’末端处的前三个核苷酸及3’末端处的最后三个核苷酸包含2'-O-Me修饰。在一些实施方案中，5’末端处的前四个核苷酸及3’末端处的最后四个核苷酸与PS键连接，且其中5’末端处的前三个核苷酸及3’末端处的最后三个核苷酸包含2’-F修饰。在一些实施方案中，上部茎区中的各核苷酸经2’-O-Me修饰。在一些实施方案中，突起区内的B1及B2经2’-O-Me修饰。在一些实施方案中，连接区中的N3、N4、N5、N15、N16、N17及N18经2’-O-Me修饰。在一些实施方案中，发夹1区中的各核苷酸经2'-O-Me修饰。在一些实施方案中，发夹2区中的各核苷酸经2'-O-Me修饰。在一些实施方案中，本发明包含tracrRNAtrRNA，其包含以下核苷酸处的2'-O-Me修饰的核酸：上部茎区中的各核苷酸；突起区内的B1及B2；连接区中的N3、N4、NS、N15、N16、N17及N18；发夹1区中的各核苷酸；及发夹2区中的各核苷酸。在一些实施方案中，trRNA进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，trRNA进一步包含5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me或2’-F修饰核苷酸，及3’末端处的最后三个核苷酸处的2’-O-Me或2’-F修饰的核酸。在一些实施方案中，N15、N16、N17及N18经2’-F修饰。在一些实施方案中，LS1、LS3及LS5经2'-F修饰，且LS2、LS4及LS6经2'-O-Me修饰。在一些实施方案中，trRNA进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些实施方案中，trRNA进一步包含5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me或2’-F修饰的核酸，及3’末端处最后三个核苷酸处的2'-O-Me或2'-F修饰的核酸。在一些实施方案中，提供trRNA，其包含SEQIDNo：188至227中任一个的核酸。在一些实施方案中，提供trRNA，其包含与SEQIDNo：188至227中任一个的核酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70％同一性的核酸，其中修饰模式与参考序列标识符中示出的修饰模式相同。在一些实施方案中，trRNA进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。在一些情况下，提供包含crRNA及trRNA的双指导，其中crRNA包含SEQIDNo：1至187中任一个的核酸，且其中trRNA包含SEQIDNo：188至227中任一个的核酸。本发明涵盖包含本文所公开的crRNA及本文所公开的trRNA的双指导，也涵盖包含本文所公开的crRNA及未经修饰的trRNA的双指导。在一些实施方案中，提供包含未经修饰的crRNA及本文所公开的经修饰的trRNA的双指导。在一些实施方案中，并涵盖以下：实施方案55.一种crisprRNAcrRNA，其包含以下区中的一个或多个中的一个或多个修饰：a.5’末端处的前五个核苷酸；b.下部茎区；c.突起区；d.上部茎区；及e.3’末端处的最后五个核苷酸。实施方案56.如实施方案55的crRNA，其中该修饰包含2'-O-甲基2'-O-Me修饰的核苷酸。实施方案57.如实施方案55的crRNA，其中该修饰包含2’-氟2’-F修饰的核苷酸。实施方案58.如实施方案55的crRNA，其中该修饰包含核苷酸之间的硫代磷酸酯PS键。实施方案59.如实施方案55至58中任一项的crRNA，其中5’末端处的前三个核苷酸及3’末端处的最后三个核苷酸经修饰。实施方案60.如实施方案55至58中任一项的crRNA，其中5’末端处的前四个核苷酸及3’末端处的最后四个核苷酸与硫代磷酸酯PS键连接。实施方案61.如实施方案59的crRNA，其中该修饰包含2'-O-Me。实施方案62.如实施方案59的crRNA，其中该修饰包含2’-F。实施方案63.如实施方案55至62中任一项的crRNA，其中5’末端处的前四个核苷酸及3’末端处的最后四个核苷酸与PS键连接，且其中5’末端处的前三个核苷酸及3’末端处的最后三个核苷酸包含2'-O-Me修饰。实施方案64.如实施方案55至62中任一项的crRNA，其中5’末端处的前四个核苷酸及3’末端处的最后四个核苷酸与PS键连接，且其中5’末端处的前三个核苷酸及3’末端处的最后三个核苷酸包含2’-F修饰。实施方案65.如实施方案55至60中任一项的crRNA，其中LS1及LS6经2’-O-Me修饰。实施方案66.如实施方案55至60及65中任一项的crRNA，其中上部茎区中的核苷酸中的每一个经2'-O-Me修饰。实施方案67.一种crisprRNAcrRNA，其包含以下处的2'-O-Me修饰核苷酸：a.下部茎区中的LS1及LS6；及b.上部茎区中的各核苷酸。实施方案68.如实施方案67的crRNA，其进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。实施方案69.如实施方案67或68的crRNA，其进一步包含5’末端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me或2’-F修饰核苷酸，及3’末端处的最后三个核苷酸处的2’-O-Me或2’-F修饰核苷酸。实施方案70.如实施方案55至60中任一项的crRNA，其中LS1、LS2及LS6经2’-F修饰。实施方案71.如实施方案55至60及70中任一项的crRNA，其中突起区中的各核苷酸经2’-F修饰。实施方案72.一种crisprRNAcrRNA，其包含以下处的2’-F修饰核苷酸：a.下部茎区中的LS1、LS2及LS6；及b.突起区中的各核苷酸。实施方案73.如实施方案70至72中任一项的crRNA，其进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。实施方案74.如实施方案72或73的crRNA，其进一步包含5’末端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me或2'-F修饰核苷酸，及3’末端处的最后三个核苷酸处的2'-O-Me或2'-F修饰核苷酸。实施方案75.一种crRNA，其包含SEQIDNo：1至187中任一个的核酸。实施方案76.一种crRNA，其包含SEQIDNo：19至31、53至73、104至130及161至187中任一个的核酸。实施方案77.一种crRNA，其包含与SEQIDNo：19至31、53至73、104至130及161至187中任一个的核酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70％同一性的核酸，其中修饰模式与参考序列标识符中示出的修饰模式相同。实施方案78.如实施方案75至77中任一项的crRNA，其进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。实施方案79.一种tracrRNAtrRNA，其包含以下区中的一个或多个中的一个或多个修饰：a.5’末端处的前五个核苷酸；b.上部茎区；c.突起区；d.下部茎区；e.连接区；f.发夹1区；g.发夹2区；及h.3’末端处的最后五个核苷酸。实施方案80.如实施方案79的trRNA，其中该修饰包含2’-O-甲基2'-O-Me修饰的核苷酸。实施方案81.如实施方案79的trRNA，其中该修饰包含2’-氟2’-F修饰的核苷酸。实施方案82.如实施方案79的trRNA，其中该修饰包含核苷酸之间的硫代磷酸酯PS键。实施方案83.如实施方案79至82中任一项的trRNA，其中5’末端处的前四个核苷酸及3’末端处的最后四个核苷酸与硫代磷酸酯PS键连接。实施方案84.如实施方案79至82中任一项的trRNA，其中5’末端处的前三个核苷酸及3’末端处的最后三个核苷酸经修饰。实施方案85.如实施方案84的trRNA，其中该修饰包含2'-O-Me。实施方案86.如实施方案84的trRNA，其中该修饰包含2’-F。实施方案87.如实施方案79至86中任一项的trRNA，其中5’末端处的前四个核苷酸及3’末端处的最后四个核苷酸与PS键连接，且其中5’末端处的前三个核苷酸及3’末端处的最后三个核苷酸包含2'-O-Me修饰。实施方案88.如实施方案79至86中任一项的trRNA，其中5’末端处的前四个核苷酸及3’末端处的最后四个核苷酸与PS键连接，且其中5’末端处的前三个核苷酸及3’末端处的最后三个核苷酸包含2'-F修饰。实施方案89.如实施方案79至84中任一项的trRNA，其中上部茎区中的各核苷酸经2'-O-Me修饰。实施方案90.如实施方案79至84及89中任一项的trRNA，其中突起区内的B1及B2经2'-O-Me修饰。实施方案91.如实施方案79至84及89至90中任一项的trRNA，其中连接区中的N3、N4、N5、N15、N16、N17及N18经2’-O-Me修饰。实施方案92.如实施方案79至84及89至91中任一项的trRNA，其中发夹1区中的各核苷酸经2’-O-Me修饰。实施方案93.如实施方案79至84及89至92中任一项的trRNA，其中发夹2区中的各核苷酸经2’-O-Me修饰。实施方案94.一种tracrRNAtrRNA，其包含以下处的2’-O-Me修饰核苷酸：a.上部茎区中的各核苷酸；b.突起区内的B1及B2；c.连接区中的N3、N4、N5、N15、N16、N17及N18；d.发夹1区中的各核苷酸；及e.发夹2区中的各核苷酸。实施方案95.如实施方案94的trRNA，其进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。实施方案96.如实施方案94或95的crRNA，其进一步包含5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me或2'-F修饰核苷酸，及3’末端处的最后三个核苷酸处的2'-O-Me或2’-F修饰的核酸。实施方案97.如实施方案79至84中任一项的trRNA，其中N15、N16、N17及N18经2'-F修饰。实施方案98.如实施方案79至84及97中任一项的trRNA，其中LS1、LS3及LS5经2’-F修饰，且LS2、LS4及LS6经2’-O-Me修饰。实施方案99.如实施方案87至98中任一项的trRNA，其进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。实施方案100.如实施方案98或99的trRNA，其进一步包含5’末端处的前三个核苷酸处的2'-O-Me或2'-F修饰核苷酸，及3’末端处的最后三个核苷酸处的2'-O-Me或2'-F修饰核苷酸。实施方案101.一种trRNA，其包含SEQIDNo：188至227中任一个的核酸。实施方案102.一种trRNA，其包含与SEQIDNo：188至227中任一个的核酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70％同一性的核酸，其中修饰模式与参考序列标识符中示出的修饰模式相同。实施方案103.如实施方案101至102中任一项的trRNA，其进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。实施方案104.一种包含crRNA及trRNA的双指导，其中crRNA包含SEQIDNo：1至187中任一个的核苷酸，且其中trRNA包含SEQIDNo：188至227中任一个的核酸。实施方案105.一种双指导，其包含如实施方案55至78中任一项的crRNA及如实施方案79至103中任一项的trRNA。实施方案106.一种双指导，其包含如实施方案55至78中任一项的crRNA及未经修饰的trRNA。实施方案107.一种双指导，其包含未经修饰的crRNA及如实施方案79至103中任一项的trRNA。C.末端核苷酸的修饰在一些实施方案中，本文所述的指导RNA中任一个的5’或3’末端核苷酸经修饰。在一些实施方案中，指导RNA，包括例如sgRNA、dgRNA、crRNA、trRNA或crRNA及trRNA两者的3’末端区中的末端也即最后1、2、3、4、5、6或7个核苷酸经修饰。在一些实施方案中，指导RNA的3’末端区中的末端也即最后1、2、3、4、5、6或7个核苷酸包含超过一个修饰。在一些实施方案中，3’末端区处的末端也即最后1、2、3、4、5、6或7个核苷酸中的至少一个经修饰。在一些实施方案中，3’末端区中的末端也即最后1、2、3、4、5、6或7个核苷酸中的至少两者经修饰。在一些实施方案中，3’末端区中的末端也即最后1、2、3、4、5、6或7个核苷酸中的至少三者经修饰。在一些实施方案中，修饰包含PS键。在一些实施方案中，5’末端区的5’端经修饰，例如sgRNA、dgRNA、crRNA、trRNA或crRNA及trRNA两者之前1、2、3、4、5、6或7个核苷酸经修饰。在一些实施方案中，指导RNA的3’末端区中之前1、2、3、4、5、6或7个核苷酸包含超过一个修饰。在一些实施方案中，5’端处的末端也即第一1、2、3、4、5、6或7个核苷酸中的至少一个经修饰。在一些实施方案中，5’端处的末端1、2、3、4、5、6或7个核苷酸中的至少两者经修饰。在一些实施方案中，5’端处的末端1、2、3、4、5、6或7个核苷酸中的至少三者经修饰。在一些实施方案中，修饰包含PS键。在一些实施方案中，指导RNA，例如sgRNA、dgRNA、crRNA、trRNA或crRNA及trRNA两者的5’及3’末端例如端部均经修饰。在一些实施方案中，仅指导RNA，例如sgRNA、dgRNA、crRNA、trRNA或crRNA及trRNA两者的5’末端经修饰。在一些实施方案中，仅指导RNA，例如sgRNA、dgRNA、crRNA、trRNA或crRNA及trRNA两者的3’末端经修饰。在一些实施方案中，gRNA包含gRNA的5’端处的前7个核苷酸中的1、2、3、4、5、6或7者处的修饰。在一些实施方案中，gRNA包含3’端处的7个末端核苷酸中的1、2、3、4、5、6或7者处的修饰。在一些实施方案中，5’端处的前4个核苷酸中的2、3或4者，及或3’端处的末端4个核苷酸中的2、3或4者经修饰。在一些实施方案中，5’端处的前4个核苷酸中的2、3或4者与硫代磷酸酯PS键连接。在一些实施方案中，对5’末端及或3’末端的修饰包含对核苷酸的2’-O-甲基2’-O-Me或2’-O-2-甲氧基乙基2’-O-moe修饰。在一些实施方案中，修饰包含对核苷酸的2’-氟2’-F修饰。在一些实施方案中，修饰包含核苷酸之间的硫代磷酸酯PS键。在一些实施方案中，修饰包含反向无碱基核苷酸。在一些实施方案中，修饰包含超过一个选自2’-O-Me、2’-O-moe、2’-氟2'-F、核苷酸之间的硫代磷酸酯PS键及反向无碱基核苷酸的修饰。在一些实施方案中，涵盖等效修饰。在一些实施方案中，指导RNA，例如sgRNA、dgRNA、crRNA、trRNA或crRNA及trRNA两者包含5’末端处的前一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个核苷酸之间的一个或多个硫代磷酸酯PS键。在一些实施方案中，指导RNA，例如sgRNA、dgRNA、crRNA、trRNA或crRNA及trRNA两者包含3’末端处的前一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个核苷酸之间的一个或多个PS键。在一些实施方案中，指导RNA，例如sgRNA、dgRNA、crRNA、trRNA或crRNA及trRNA两者包含5’末端及3’末端处的最后一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个核苷酸之间的一个或多个PS键。在一些实施方案中，除PS键以外，5’及3’末端核苷酸可包含2’-O-Me、2’-O-moe或2'-F修饰核苷酸。在一些实施方案中，指导RNA，例如sgRNA、dgRNA、crRNA、trRNA或crRNA及trRNA两者包含5’及3’末端处的经修饰的核苷酸，及表1-3及图21A或21C中所述的一个或多个其他区中的经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，crRNA、trRNA或crRNA及trRNA两者包含不在5’或3’末端处的经修饰的核苷酸。特定修饰模式描述于下文及表4中。3.gRNA及Cas蛋白质的递送在一些实施方案中，除至少一个gRNA以外，本文提供的组合物另外包含核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶为Cas蛋白质。在一些实施方案中，gRNA连同Cas蛋白质称作CasRNP。在一些实施方案中，Cas蛋白质是来自Type-IICRISPRCas系统。在一些实施方案中，Cas蛋白质为Cas9。在一些实施方案中，Cas9蛋白质为野生型Cas9。在一些实施方案中，Cas9蛋白质源自酿脓链球菌StreptococcuspyogenesCas9蛋白质，例如酿脓链球菌Cas9。在一些实施方案中，Cas9蛋白质不源自酿脓链球菌，但以与酿脓链球菌Cas9相同的方式起作用，使得对酿脓链球菌Cas9具有特异性的gRNA将引导非酿脓链球菌Cas9至其目标位点。在一些实施方案中，Cas诱发标靶DNA中的双链断裂。本文所述的实施方案涵盖酿脓链球菌Cas9蛋白质的等效物。Cas9涵盖其经修饰形式及变体。具有一个非活性催化结构域RuvC或HNH的Cas9的经修饰形式被称为“切口酶”。切口酶仅切割标靶DNA上的一条链，因此产生单链断裂。单链断裂也可称为“切口”。在一些实施方案中，组合物及方法包含切口酶。在一些实施方案中，组合物及方法包含在标靶DNA中诱发切口而非双链断裂的切口酶Cas9。在一些实施方案中，Cas蛋白质可经修饰以仅含有一个功能核酸酶结构域。举例而言，Cas蛋白质可经修饰以使得核酸酶结构域中的一个经突变或完全或部分缺失以降低其核酸切割活性。在一些实施方案中，使用具有活性降低的RuvC结构域的切口酶Cas。在一些实施方案中，使用具有非活性RuvC结构域的切口酶Cas。在一些实施方案中，使用具有活性降低的HNH结构域的切口酶Cas。在一些实施方案中，使用具有非活性HNH结构域的切口酶Cas。在一些实施方案中，Cas蛋白质核酸酶结构域内的保守氨基酸经取代以降低或改变核酸酶活性。在一些实施方案中，Cas蛋白质可包含RuvC或RuvC样核酸酶结构域中的氨基酸取代。RuvC或RuvC样核酸酶结构域中的例示性氨基酸取代包括D10A基于酿脓链球菌Cas9蛋白质。在一些实施方案中，Cas蛋白质可包含HNH或HNH样核酸酶结构域中的氨基酸取代。HNH或HNH样核酸酶结构域中的例示性氨基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A及D986A基于酿脓链球菌Cas9蛋白质。在一些实施方案中，本文所述的RNP复合物包含切口酶及一对分别与靶序列的有义链及反义链互补的指导RNA。在此实施方案中，指导RNA将切口酶引导至靶序列且通过在靶序列的相对链上产生切口也即双重切口引入双链断裂DSB。在一些实施方案中，使用双重切口可提高特异性及减少脱靶效应。在一些实施方案中，连同靶向DNA的相对链的两个独立指导RNA使用切口酶Cas以在标靶DNA中产生双重切口。在一些实施方案中，与经选择以非常接近的两个独立指导RNA一起使用切口酶Cas以在标靶DNA中产生双重切口。在一些实施方案中，使用嵌合Cas蛋白质，其中蛋白质的一个结构域或区经不同蛋白质的一部分取代。在一些实施方案中，Cas核酸酶结构域可经来自诸如Fok1的不同核酸酶的结构域取代。在一些实施方案中，Cas蛋白质可经核酸酶修饰。在一些实施方案中，Cas蛋白质包含融合蛋白，其包含连接至异源功能性结构域的催化非活性Cas9参见例如WO2014152432。在一些实施方案中，催化非活性Cas9来自酿脓链球菌。在一些实施方案中，催化非活性Cas9包含使Cas9不活化的突变。在一些实施方案中，异源功能性结构域为修饰基因表现、组蛋白或DNA的结构域。在一些实施方案中，异源功能性结构域为转录活化结构域或转录抑制因子结构域。A.PAM在一些实施方案中，靶序列可邻近于PAM。在一些实施方案中，PAM可邻近于或在靶序列的3’端的1、2、3或4个核苷酸内。PAM的长度及序列可取决于使用的Cas蛋白质。举例而言，PAM可选自共有序列或用于特定Cas9蛋白质或Cas9直向同源物的特定PAM序列，包括公开于Ran等人，Nature520：186-1912015的图1中的那些，该文献以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，PAM可包含长度为2、3、4、5、6、7、8、9或10个的核苷酸。非限制例示性PAM序列包括NGG、NAG、NGA、NGAG、NGCG、NNGRRT、TTN、NGGNG、NG、NAAAAN、NNAAAAW、NNNNACA、GNNNCNNA及NNNNGATT其中N定义为任何核苷酸，且W定义为A或T，且R定义为A或G。在一些实施方案中，PAM序列可为NGG。在一些实施方案中，PAM序列可为NGGNG。在一些实施方案中，PAM序列可为NNAAAAW。B.经修饰gRNA的递送脂质纳米颗粒LNP为递送核苷酸及蛋白质货物cargo的熟知方法，且可用于递送本文所公开的gRNA、mRNA、Cas9及RNP。在一些实施方案中，LNP递送核酸、蛋白质或核酸以及蛋白质。在一些实施方案中，本发明包含向个体递送本文所公开的gRNA中任一个的方法，其中gRNA与LNP结合。在一些实施方案中，gRNALNP也与Cas9或编码Cas9的mRNA联合。在一些实施方案中，本发明包含含有所公开的gRNA中任一个及LNP的组合物。在一些实施方案中，组合物进一步包含Cas9或编码Cas9的mRNA。在一些实施方案中，LNP包含阳离子脂质。在一些实施方案中，LNP包含9Z，12Z-3-4，4-双辛氧基丁酰基氧基-2-3-二乙胺基丙氧基羰基氧基甲基丙基十八-9，12-二烯酸酯，也称作3-4，4-双辛氧基丁酰基氧基-2-3-二乙胺基丙氧基羰基氧基甲基丙基9Z，12Z-十八-9，12-二烯酸酯。在一些实施方案中，LNPs包含约4.5的阳离子脂质胺与RNA磷酸酯的摩尔比N∶P。在一些实施方案中，与本文所公开gRNA结合的LNP是用于制备用于治疗疾病或病症的药物。电穿孔为递送货物的熟知方法，且任何电穿孔方法可用于递送本文所公开的gRNA中任一个。在一些实施方案中，电穿孔可用于递送本文所公开的gRNA中任一个及Cas9或编码Cas9的mRNA。在一些实施方案中，本发明包含将本文所公开的gRNA中任一个递送至离体细胞的方法，其中gRNA与LNP结合或不与LNP结合。在一些实施方案中，gRNALNP或gRNA也与Cas9或编码Cas9的mRNA结合。4.基因调节方法在一些实施方案中，本发明包含药物制剂，其包含本文所公开的gRNA中任一个以及可药用载体。在一些实施方案中，本发明包含药物制剂，其包含本文所公开的gRNA中任一个及LNP以及可药用载体。在一些实施方案中，本发明包含药物制剂，其包含本文所公开的gRNA中任一个、Cas9蛋白质或编码Cas9蛋白质的mRNA、LNP以及可药用载体。在一些实施方案中，药物制剂用于制备用于治疗疾病或病症的药物。在一些实施方案中，本发明包含治疗人类患者的方法，其包含施用本文所述的gRNA或药物制剂中任一个。在一些实施方案中，本发明包含修饰标靶DNA的方法或用途，其包含施用或递送Cas蛋白质或CasmRNA及本文所公开的gRNA中的任何一个或多个。在一些实施方案中，本发明包含调节靶基因的方法或用途，其包含施用或递送Cas蛋白质或CasmRNA及本文所公开的gRNA中的任何一个或多个。在一些实施方案中，调节为靶基因编辑。在一些实施方案中，调节为通过靶基因编码的蛋白质的表达的变化。在一些实施方案中，该方法或用途导致基因编辑。在一些实施方案中，该方法或用途导致靶基因内的双链断裂。在一些实施方案中，该方法或用途导致在DSB的非同源末端接合期间形成插入缺失突变。在一些实施方案中，该方法或用途导致靶基因中的核苷酸的插入或缺失。在一些实施方案中，靶基因中的核苷酸的插入或缺失导致移码突变或提前终止密码子，其产生非功能蛋白质。在一些实施方案中，靶基因中的核苷酸的插入或缺失导致靶基因表现的敲除或消除。在一些实施方案中，该方法或用途包含DSB的同源性定向修复。在一些实施方案中，该方法或用途进一步包含向细胞递送模板，其中模板的至少一部分并入至通过Cas蛋白质诱发的双链断裂位点处或附近的标靶DNA中。在一些实施方案中，该方法或用途导致基因调节。在一些实施方案中，基因调节为基因表现的增加或减少、DNA的甲基化状态的变化或组蛋白亚基的修饰。在一些实施方案中，该方法或用途导致通过靶基因编码的蛋白质的表达增加或减少。在一些实施方案中，本文所公开的gRNA中任一个可适用于制备用于治疗疾病或病症的药物。A.基因调节的测量可在体外及体内测试经修饰的gRNA的功效。在一些实施方案中，本发明包含本文所公开的gRNA中的一个或多个，其中gRNA在与Cas9一起提供至细胞时导致基因调节。在一些实施方案中，gRNA的功效可在体外或体内分析中测量。1.体外测量Cas功效在一些实施方案中，将包含经修饰的sgRNA的CasRNP的活性与包含未经修饰的sgRNA的CasRNP的活性进行比较。在一些实施方案中，将包含含有经修饰的trRNA的dgRNA的CasRNP的活性与包含含有未经修饰的trRNA的dgRNA的CasRNP的活性。在一些实施方案中，将包含含有经修饰的crRNA的dgRNA的CasRNP的活性与包含含有未经修饰的crRNA的dgRNA的CasRNP的活性进行比较。在一些实施方案中，将包含含有经修饰的crRNA及经修饰的trRNA的dgRNA的CasRNP的活性与包含未经修饰的crRNA及未经修饰的trRNA的CasRNP的活性进行比较。在一些实施方案中，gRNA增加或减少靶蛋白表达的效率通过测量靶蛋白的量确定。在一些实施方案中，本发明包含本文所述的gRNA中任一个，其中gRNA增加或减少产生自靶向基因的蛋白质的量。在一些实施方案中，本发明包含调节蛋白质表现的方法，其包含向个体施用本文所公开的gRNA中任一个，其中gRNA将Cas9引导至编码靶蛋白的基因，且相比于不将Cas9靶向至该基因的gRNA对照，靶蛋白表达增加或减少。在一些实施方案中，经特定gRNA编辑的效率是通过递送Cas9及gRNA包含crRNA及trRNA的sgRNA或dgRNA之后存在于基因组中的目标位置处的编辑测定。在一些实施方案中，经特定gRNA编辑的效率通过第二代测序来测量。在一些实施方案中，测定目的靶区结构域的编辑百分比。在一些实施方案中，在递送gRNA及Cas9之后测量相比于序列读段总数的具有向目的靶区结构域中的核苷酸插入或缺失的序列读段总数。在一些实施方案中，本发明包含增加基因编辑效率的方法，其包含向细胞施用或递送本文所述的经修饰的gRNA中任一个，其中基因编辑的百分比相比于未经类似修饰的对照gRNA增加。在一些实施方案中，经特定gRNA编辑的效率通过经成功基因编辑引入的核苷酸插入或缺失的存在来测量。在一些实施方案中，本发明包含在基因中产生核苷酸插入或缺失的方法，其包含向细胞施用或递送本文所述的经修饰的gRNA中的任一个，其中相比于未经类似修饰的对照gRNA，核苷酸插入或缺失。在一些实施方案中，在生物化学分析中测试Cas9及gRNA的活性。在一些实施方案中，在无细胞切割分析中测试Cas9及gRNA的活性。在一些实施方案中，在Neuro2A细胞中测试Cas9及gRNA的活性。在一些实施方案中，相比于包含未经修饰的crRNA及trRNA的未经修饰的sgRNA或dgRNA，Cas9及包含经修饰的crRNA及或trRNA的sgRNA或dgRNA显示类似、较大或减小的活性。在一些实施方案中，相比于包含未经修饰的crRNA及trRNA的未经修饰的sgRNA或dgRNA，Cas9及包含经修饰的crRNA及或trRNA的经修饰的sgRNA或dgRNA显示增强的活性。2.体内测量Cas功效在一些实施方案中，经修饰的gRNA的活性在体内施用包含经修饰的gRNA及Cas蛋白质或编码Cas蛋白质的mRNA的LNP之后测量。在一些实施方案中，本文提供的gRNA或组合物的体内功效是通过在施用gRNA及Cas9之后编辑从组织例如肝组织提取的DNA中测量的功效测定。3.体内测量免疫系统活化如本文所公开的gRNA的修饰可减少个体对体内施用gRNA的免疫反应。在一些实施方案中，个体的免疫反应的活化是通过体内施用包含trRNA及crRNA的sgRNA或dgRNA连同Cas9mRNA或蛋白质例如在LNP中配制之后的一种或多种细胞因子的血清浓度来测量。在一些实施方案中，细胞因子为干扰素-αIFN-α、白介素6IL-6、单核细胞趋化蛋白1MCP-1及或肿瘤坏死因子αTNF-α。在一些实施方案中，本发明包含降低个体对递送gRNA的免疫反应的方法，其包含施用本文所公开的gRNA中任一个，其中gRNA在施用后通过个体的免疫系统产生降低的反应。在一些实施方案中，本发明包含相比于未经类似修饰的对照gRNA，在施用后降低个体的免疫系统中的活化的方法。在一些实施方案中，相比于施用未经修饰的sgRNA，施用CasRNP或Cas9mRNA连同经修饰的gRNA例如sgRNA或dgRNA产生免疫细胞因子的较低血清浓度。在一些实施方案中，本发明包含降低个体的免疫细胞因子的血清浓度的方法，其包含施用本文所公开的gRNA中任一个，其中相比于未经类似修饰的对照gRNA，gRNA在个体的血清中产生免疫细胞因子的较低浓度。不应将本说明书和示例性实施方案视为限制。为了本说明书和所附权利要求的目的，除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例以及其他数值的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰，程度为其尚未如此修饰。因此，除非有相反的指示，否则在本说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据试图获得的所需性质而变化。至少，并不是试图将等同原则的应用限制在权利要求的范围内，每个数值参数至少应该根据所报导的有效数字的数量并通过应用一般舍入技术来解释。应注意，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该所述”，以及任何单词的任何单数用法，包括复数指示物，除非明确且不含糊地限于一个指示物。如本文所用，术语“包括”及其语法变体旨在是非限制性的，使得列表中的项目的叙述不排除可以替换或添加到所列项目的其他类似项目。实施例提供以下实例以说明某些所公开的实施方案且不应理解为以任何方式限制本发明的范畴。实施例1-材料及方法A.合成性指导RNAgRNA通过商业供货商以如表4中所提供的经修饰核苷酸及键结方式，利用化学方式合成呈双指导dgRNA，也即crRNA及trRNA及单指导sgRNA两种形式的gRNA。B.Cas9mRNA的体外转录“IVT”含有N1-甲基假-U的封端及聚腺苷酸化Cas9mRNA是通过使用线性化质粒DNA模板及T7RNA聚合酶的体外转录产生。含有T7启动子及100个核苷酸nt的聚AT区的质粒DNA通过XbaI线性化且获自商业制造商。用于产生Cas9修饰的mRNA的IVT反应物在37℃下在以下条件下孵育4小时：50ngμL线性化质粒；2mM的GTP、ATP、CTP及N1-甲基假-UTPTrilink中的每一个；10mMARCATrilink；5UμLT7RNA聚合酶NEB；1UμL鼠RNA酶抑制剂NEB；0.004UμL无机大肠杆菌焦磷酸酶NEB；及1×反应缓冲液。在4小时孵育之后，添加TURBO脱氧核糖核酸酶ThermoFisher至0.01UμL的最终浓度，且再孵育反应物30分钟以移除DNA模板。Cas9mRNA使用标准方案纯化自酶及核苷酸，包括二氧化硅结合柱，诸如MegaClearTranscriptionClean-up试剂盒ThermoFisher或使用LiCl继之以EtOH与NaOAc的沉淀步骤。通过测量260nm处的光吸收Nanodrop测定转录物浓度，且通过以BioanlayzerAgilent进行毛细电泳法而分析转录物。C.Neuro2A细胞中的Cas9mRNA及gRNA转染小鼠细胞株Neuro2A在补充有10％小牛血清的DMEM培养基中培养且在转染之前24小时以每孔15,000个细胞的密度铺板于96孔板中。在转染当天，自细胞抽吸培养基且经新鲜培养基替换。脂转染胺-2000Invitrogen在Opti-MEMInvitrogen中以1∶50vv稀释。Cas9mRNA及单指导RNA在Opti-MEM中分开稀释。对于双指导形式，crRNA及trRNA在Opti-MEM中以1∶1摩尔比稀释在一起。Cas9mRNA及gRNA分开与稀释的脂转染胺-2000以1∶1vv混合，产生两种脂复合体。在孵育5分钟之后，将脂复合体连续添加至细胞，以得到100ngCas9mRNA孔的最终浓度及0.4μL总脂质粒转染试剂。对于各实验以两个剂量水平进行测试，包括25nM及2.5nM、16.7nM及1.67nM、10nM及1nM、8.3nM及0.83nM以及3nM及0.3nM。对于双指导，此浓度包括等摩尔量的crRNA及trRNA，使得例如25nMcrRNA及25nMtrRNA产生25nM总双指导。细胞在转染后24小时裂解，且裂解物直接用于通过NGS分析编辑的PCR反应。具有1xNLS的Cas9mRNASEQIDNO：359：具有2xNLS及HA标签的Cas9mRNASEQIDNO：360：D.初生肝细胞根据制造商的方案Invitrogen，方案11.28.2012培养初生小鼠肝细胞PMHGibco。简言之，将细胞解冻且再悬浮于具有补充剂的肝细胞解冻培养基Gibco，目录号CM7000中，接着在100g下离心10分钟。弃去上清液且沉淀的pelleted细胞再悬浮于肝细胞铺板培养基加上补充包Invitrogen，目录号A1217601及CM3000中。细胞经计数且以每孔15,000个细胞的密度铺板于Bio-coat胶原蛋白I涂布的96孔板ThermoFisher，目录号877272上且在37℃及5％CO2氛围下孵育5小时以允许形成单层。在5小时之后，移除铺板培养基且经含有LNP配制的Cas9mRNA及指导RNA加上3％小鼠血清的补充的肝细胞培养基Invitrogen，目录号A1217601及CM4000替换。LNP自每孔100ngCas9mRNA及大致30nM指导RNA的起始剂量水平稀释，进行连续稀释直至每孔0.1ngmRNA及0.03nM指导RNA。细胞在37℃及5％CO2氛围下孵育大致48小时，随后进行如本文所述的细胞裂解及NGS分析。E.脂质纳米颗粒“LNP”配制物LNP以约4.5的阳离子脂质胺与RNA磷酸酯N∶P摩尔比配制。脂质纳米颗粒组分以如下摩尔比溶解于100％乙醇中：45mol％12.7mM阳离子脂质例如9Z，12Z-3-4，4-双辛氧基丁酰基氧基-2-3-二乙胺基丙氧基羰基氧基甲基丙基十八-9，12-二烯酸酯，也称作3-4，4-双辛氧基丁酰基氧基-2-3-二乙胺基丙氧基羰基氧基甲基丙基9Z，12Z-十八-9，12-二烯酸酯；44mol％12.4mM辅助脂质例如胆固醇；9mol％2.53mM中性脂质例如DSPC；及2mol％.563mMPEG例如PEG2k-DMG。RNA货物在25mM乙酸钠缓冲液，pH4.5中制备，产生大致0.45mgmL的RNA货物浓度。LNP是通过根据制造商的方案，使用PrecisionNanosystemsNanoAssemblrTM台式仪器将脂质及RNA溶液微流体混合而形成。使用差分流动速率在混合期间维持水相与有机溶剂的2∶1比率。LNP配制方案A：在混合之后，收集LNP，在磷酸盐缓冲盐水PBS，大致1∶1中稀释，且接着将其余的缓冲液交换至PBS中样品体积100倍过量，在4℃下在使用10kDaSlide-a-LyzerTMG2透析盒ThermoFisherScientific温和搅拌下过夜。LNP使用10kDaAmicon自旋过滤器浓缩在4000g在4℃下离心以达成所需浓度。所得混合物接着使用0.2μm无菌过滤器过滤。所得滤液储存于2-8℃下。LNP配制方案B：在混合之后，收集LNP，在pH7.5的50mMTris中稀释大致1∶1，且接着将LNP交换至pH7.5的50mMTris中样品体积100倍过量，在4℃下在使用10kDaSlide-a-LyzerTMG2透析盒ThermoFisherScientific温和搅拌下过夜。LNP使用10kDaAmicon自旋过滤器浓缩在4000g在4℃下离心以达成所需浓度的两倍。这些浓缩的LNP与pH7.5的50mMTris、90mMNaCl、10％蔗糖2×TSS1∶1混合。所得混合物接着使用0.2μm无菌过滤器过滤。所得滤液储存于-80℃下。LNP配制物方案C：RNA货物在pH5的25mM柠檬酸钠、100mM氯化钠中制备，产生大致0.45mgmL的RNA货物的浓度。在混合之后，LNP以3∶1的比率于水中收集。LNP在室温下孵育一小时且与水1∶1混合。接着，其使用制造商的方案，在PD-10柱GEHealthcare上缓冲液交换至1×TSSpH7.5的50mMTris，45mMNaCl，5％蔗糖中。LNP使用10kDaAmicon自旋过滤器浓缩在4000g在4℃下离心以达成所需浓度。所得混合物接着使用0.2μm无菌过滤器过滤。所得滤液储存于-80℃下。F.用于命中切割效率的第二代测序“NGS”及分析为了定量地测定基因组中的目标位置处的编辑效率，深度测序用于识别通过基因编辑引入的插入及缺失的存在。在目标位点例如TTR、FVII周围设计PCR引物，且扩增目的基因组区结构域。引物序列提供于下表5中。表5根据制造商的方案Illumina进行额外PCR以对于测序添加所需化学性质。在IlluminaMiSeq仪器上对扩增子测序。在消除具有低质量评分的读段之后，将读段与人类参考基因组例如hg38比对。将含有读段的所得档案映像至参考基因组BAM档案，其中选择与目的靶区结构域重叠的读段且计算野生型读段的数目相对于含有插入、取代或缺失的读段的数目。编辑百分比例如“编辑效率”或“编辑％”定义为具有插入或缺失的序列读段的总数相比于包括野生型的序列读段的总数。G.体内的LNP递送在6-10周龄范围内的CD-1雌性小鼠用于各研究。对动物称重且根据体重分组以基于组平均体重制备施用溶液。经由侧尾静脉以每只动物0.2mL每公斤体重大致10mL的体积施用LNP。在给药后大致6小时时，对动物观测副作用。在投药后二十四小时处测量体重，且动物通过在异氟烷麻醉下经由心脏穿刺放血而在各个时间点安乐死。将血液收集至血清分离管中或含有用于如本文所述的血浆的缓冲柠檬酸钠的管中。对于涉及体内编辑的研究，肝组织收集自来自各动物的中叶以用于DNA提取及分析。H.细胞因子诱导分析对于此分析，通过尾静脉切口收集大致50-100μL血液用于血清细胞因子测量。使血液在室温下凝固大致2小时，且接着在1000xg下离心10分钟，随后收集血清。测量IL-6、TNF-α、IFN-α及MCP-1的基于Luminex的磁珠多重分析AffymetrixProcartaPlus，目录号Exp040-00000-801用于收集样品中的细胞因子分析。如制造商的方案中所指导地制备试剂盒试剂及标准品。将25μL小鼠血清添加至含有25μL稀释抗体涂布的磁珠的孔中。将平板在室温下孵育2小时且接着洗涤。稀释生物素抗体50μL添加至小珠且在室温下孵育1小时。再次洗涤小珠，随后添加50μL稀释抗生蛋白链菌素-PE至各孔，接着孵育30分钟。再次洗涤小珠且接着悬浮于100μL洗涤缓冲剂中且在Bio-Plex200仪器Bio-Rad上读取。使用BioplexManager版本6.1分析程序包，通过使用五参数逻辑曲线拟合脱离标准曲线计算的细胞因子浓度分析数据。I.基因组DNA分离对于体内研究，使用基于小珠的提取试剂盒MagMAX-96DNA多样品试剂盒ThermoFisher，目录号4413020，根据制造商的方案从10mg组织中提取基因组DNA，该方案包括使组织在裂解缓冲液中匀浆大致400μL10mg组织。所有DNA样品标准化至100ngμL浓度以用于PCR及后续NGS分析，如本文所述。J.运甲状腺素蛋白TTRELISA分析收集血液且如所指示地分离血清。使用小鼠前白蛋白运甲状腺素蛋白ELISA试剂盒AvivaSystemsBiology，目录号OKIA00111测定总TTR血清水平。根据制造商的方案制备试剂盒试剂及标准品。通过1×分析稀释剂将小鼠血清稀释至10,000倍的最终稀释度。此如下进行：进行两个连续50倍稀释，产生2500倍稀释。进行最终4倍稀释步骤以使得总样品稀释度为10,000倍。标准曲线稀释液各100μL及稀释的血清样品均添加至预涂有捕捉抗体的ELISA板的各孔中。平板在室温下孵育30分钟，随后洗涤。添加酶-抗体缀合物100μL孔进行20分钟孵育。移除非结合抗体缀合物且再次洗涤该平板，随后添加显色底物溶液。孵育该平板10分钟，随后添加100μL终止溶液，例如硫酸大致0.3M。在SpectraMaxM5平板读取器上以450nm的吸光度读取该平板。使用脱离标准曲线的四参数逻辑曲线拟合通过SoftMaxPro软件版本6.4.2计算血清TTR水平。对于分析稀释调节最终血清值。实施例2-改造经修饰的gRNA及体外测试以双指导形式dgRNA设计经修饰的gRNA，如表4中所示。因此，经修饰的crRNA及trRNA均经设计及化学合成以允许形成dgRNA的经修饰及未经修饰的组分的配对。这些配对以如图式中所指示的浓度转染至Neuro2A细胞中且通过NGS来测量编辑效率例如编辑％，如实施例1中所述。靶向小鼠TTR基因的某些来自表4的经修饰的crRNA经Cas9mRNA及未经修饰的trRNATR000002转染。测试的指导包括SEQIDNo：1至18。如图1中所示，相比于未经修饰的对照，经修饰的crRNA中的一些连同未经修饰的trRNA赋予类似或增强的活性，而其他经修饰的crRNA降低活性。同时，来自表4的经修饰的trRNA经靶向小鼠TTR基因的相同序列的Cas9mRNA连同未经修饰的crRNACR000686转染。测试的指导包括SEQIDNo：188至200及204。如图2中所示，相比于未经修饰的对照，许多经修饰的trRNA连同未经修饰的crRNA赋予类似或增强的活性，而经修饰的trRNA中的一些降低活性。除取代化学修饰的核苷酸以外，测试的crRNA及trRNA配对中的一些也经序列取代改造，例如产生未发现于亲本序列中的G-C配对。测试的指导包括SEQIDNo：15及201；SEQIDNo：16及202；SEQIDNo：1及188。如图3中所示，相比于未经修饰的对照，一个此类配对SEQIDNo：16及202产生类似或增强的活性，而配对中的两个降低活性。随后，测试来自表4的经修饰的crRNA及经修饰的trRNA的配对。如图4中所示，相比于未经修饰的对照，经修饰的crRNA与经修饰的trRNA的配对中的一些赋予类似或增强的活性，而配对中的一些降低活性。在图4中，标题行描绘用于实验中的不同trRNA，且标题列描绘使用的不同crRNA。为了确定用于实验中的组合，将行与列匹配。TR000002及CR000686为未经修饰的对照参见右下方细胞。基于dgRNA设计，改造相应的单指导RNAsgRNA，以具有经修饰的crRNA及trRNA中的一些的特征aspect，如表4及图15D中所示。这些sgRNA，SEQIDNo：228至234也在Neuro2A细胞中测试，且如图5中所示，经修饰的sgRNA中的每一个显示与仅含有5’及3’端修饰的对照G0000209；SEQIDNO：228类似的活性。对于表4及图6中描绘的额外dgRNA指导进行类似实验集合。测试的指导包括SEQIDNo：32至47及1。也靶向小鼠TTR基因的经修饰的crRNA经Cas9mRNA及未经修饰的trRNATR000002转染。如图6中所示，相比于未经修饰的对照CR000686，一些经修饰的crRNA连同未经修饰的trRNA赋予类似或增强的活性，而其他经修饰的crRNA降低活性。同时，如图7中所示，来自表4的经修饰的trRNA经靶向小鼠TTR基因的相同序列的Cas9mRNA连同未经修饰的crRNACR000686转染。测试的指导包括SEQIDNo：205至222及1。如图7中所示，相比于未经修饰的对照TR000002，许多经修饰的trRNA连同未经修饰的crRNA赋予类似或增强的活性，而经修饰的trRNA中的一些降低活性。除取代化学修饰的核苷酸以外，来自表4的测试的crRNA及trRNA配对中的一些也经序列取代改造，例如产生未发现于亲本序列中的G-C配对或G-U错配“GU摆动”。如图8中所示，相比于未经修饰的对照，修饰及配对中的一些赋予类似或增强的活性，而一些例如“GU摆动”或错配的配对降低活性。图8显示使用SEQIDNo：223至227及188中示出的trRNA指导与SEQIDNo：48至52及1中示出的crRNA指导的结果。随后，如图9中所示地测试来自表4的经修饰的crRNA及经修饰的trRNA的选定配对。相比于未经修饰的对照，经修饰的crRNA与经修饰的trRNA的配对中的一些赋予类似或增强的活性，而配对中的一些降低活性。在图9中，标题行描绘用于实验中的不同trRNA，且标题列描绘使用的不同crRNA。为了确定用于实验中的组合，将行与列匹配。未经修饰的对照为TR000002及CR000686。也在纯粹生物化学分析也即无细胞切割分析中测试来自表4的经修饰的gRNAdgRNA及sgRNA中的一些。有趣的是，许多在Neuro2A细胞中在很大程度上非活性的经修饰的gRNA在生物化学分析中具活性，指示此类生物化学分析可能无法预测细胞阻止经修饰的gRNA活性资料未示出。实施例3.对于其他标靶进一步测试经修饰的gRNA已确定某些修饰影响gRNA活性，随后测试这些修饰是否将在靶向1相同基因中的独立序列或2不同基因中的序列时影响活性。因此，靶向小鼠TTR基因中的另一序列以及小鼠因子-VIIFVII基因中的序列的gRNA经改造及合成以具有实施例2中测试的某些修饰模式参见表4。这些gRNA以如图式中所指示的浓度转染至Neuro2A细胞中且通过NGS来测量编辑效率例如编辑％，如实施例1中所述。靶向小鼠TTR基因与实施例2中所靶向不同的序列或小鼠FVII基因的来自表4的经修饰的crRNA经Cas9mRNA及未经修饰的trRNATR000002转染。测试的指导包括图12A及12B中所展示的那些。相比于未经修饰的对照，一些经修饰的crRNA连同未经修饰的trRNA赋予类似或增强的活性，而其他经修饰的crRNA降低活性。同时，来自表4的经修饰的trRNA经靶向小鼠TTR基因的相同序列CR000705；与实施例2中所靶向不同的序列或与小鼠FVII基因相同的序列CR000657的Cas9mRNA连同未经修饰的crRNA转染。如图13A及13B中所示，相比于未经修饰的对照，许多经修饰的trRNA连同未经修饰的crRNA赋予类似或增强的活性，而经修饰的trRNA中的一些降低活性。此数据显示某些修饰模式倾向于经不同序列具有类似效应。基于上文所述的dgRNA设计，改造相应的单指导RNAsgRNA以具有经修饰的crRNA及trRNA中的一些的态样。参见表4。也在Neuro2A细胞中测试这些sgRNA。结果显示于图10小鼠TTR及图11小鼠FVII中。这些实验显示一些修饰模式即使在靶向不同基因时也产生类似效应。实施例4.体内测试经修饰的gRNA在体外测试之后，将经修饰的sgRNA在六个独立研究中递送至动物以判定修饰是否赋予体内编辑任何益处。LNP经IVTCas9mRNA连同化学修饰的sgRNA靶向TTR或FVII配制，如实施例1中所述。按RNA组分的重量计，mRNA∶sgRNA的比率大致为1∶1。除非另外规定，否则用于此实施例中所述的研究中的Cas9mRNA具有SEQIDNO：360的序列且LNP是使用上文所述的LNP配制方案A配制。在一个实验中，以2mgkg向小鼠n＝5只每组施用LNP的单次剂量且在给药后四小时收集血液用于血清细胞因子分析。给药后7天，在尸检时收集肝及血液分别用于编辑效率的NGS测量及血清TTR分析。此实验中的sgRNA中的每一个靶向TTR基因中的相同序列，sgRNA之间的唯一差别为对每一个作出的修饰参见图14A至D及15A至E；表4SEQIDNo：228至234。G000209测试两个批次充当较少修饰的对照，仅分别在sgRNA的5’及3’末端处的三个末端核苷酸处及之间具有2'-O-甲基修饰及硫代磷酸酯键。参见图15D。图14A至D中展示的结果显示相比于较少修饰的G000209对照，在更大程度上修饰的sgRNA倾向于对于分析的细胞因子中的每一个诱发较小反应。在更大程度上修饰的sgRNA也在治疗的动物的肝中赋予较大编辑效率，其中相比于较少修饰的对照G000209批次的约44-47％，在更大程度上修饰的sgRNA中的两者例如G000263及G000267的编辑％达到约60％图15A。重要的是，编辑效率与表型变化相关，因为TTR水平的血清敲低与较少修饰的对照相当或显著更大参见例如图15A至15B中的G000263及G000267相对于G000209批次。末端修饰的G000209与高度修饰的G000267之间的差异概述于图15D及15E中2’-O-Me修饰核苷酸以粗体显示，且＊表示硫代磷酸酯键。在另一体内研究中，测试三种靶向小鼠TTR基因中的独立序列的sgRNA。以2mgkg、1mgkg或0.3mgkg向小鼠n＝5只每组施用LNP的单次剂量。在给药后四小时收集血液用于血清细胞因子分析。给药后7天，在尸检时收集肝及血液分别用于编辑效率的NGS测量及血清TTR分析。在此研究中，sgRNA中的每一个靶向TTR基因中的相同序列与前述体内研究中靶向的序列不同的序列，其中一个sgRNA完全未经修饰G000201SEQIDNO：243，另一个仅具有末端修饰G000211SEQIDNO：241，分别在sgRNA的5’及3’末端处的三个末端核苷酸处及之间具有2'-O-甲基修饰及硫代磷酸酯键，且第三个sgRNA具有与前述体内研究中的G000267相同的修饰模式G000282SEQIDNO：242。如图16A至16D中所示，sgRNA中的每一个对于测试的细胞因子中的每一个以剂量依赖性方式产生类似反应。对于编辑效率，未经修饰的sgRNAG000201SEQIDNO：243赋予极小体内编辑，而在很大程度上修饰的sgRNAG000282SEQIDNO：242在2mgkg的剂量下赋予达到约60％的水平，其显著大于在较少修饰的sgRNAG000211SEQIDNO：241的情况下实现的水平图17A及B。如同前述体内研究，编辑水平与血清TTR敲除的量相关图17C及D。随后通过靶向小鼠TTR基因中的不同TTR序列靶向与两个前述体内研究中靶向的序列不同的序列的另外三个sgRNA的集合进行与第二体内研究类似的研究。以2mgkg、1mgkg或0.3mgkg向小鼠n＝5只每组施用LNP的单次剂量。在给药后四小时收集血液用于血清细胞因子分析。给药后7天，在尸检时收集肝及血液分别用于编辑效率的NGS测量及血清TTR分析。在此研究中，sgRNA中的每一个靶向TTR基因中的相同序列与前述两个体内研究中靶向的序列不同的序列，其中一个sgRNA完全未经修饰G000285；SEQIDNO：332，另一个仅具有末端修饰G000269SEQIDNO：330，分别在sgRNA的5’及3’末端处的三个末端核苷酸处及之间具有2'-O-甲基修饰及硫代磷酸酯键，且第三个sgRNA具有与前述两个体内研究中的G000267及G000282相同的修饰模式G000283SEQIDNO：331。在此研究中，未经修饰的sgRNAG000285SEQIDNO：332赋予极小体内编辑，而在很大程度上修饰的sgRNAG000283SEQIDNO：331在2mgkg的剂量下赋予达到约60％的水平，其显著大于在较少修饰的sgRNAG000269SEQIDNO：330的情况下实现的水平图18A至18B。如同前述体内研究，编辑水平与血清TTR敲除的量相关图18C。在第四体内研究中，对于另一基因FVII评估对gRNA的修饰的效应。对于研究内比较，包括第一体内研究中测试的sgRNA中的两个G000209及G000267。以2mgkg、1mgkg或0.3mgkg向小鼠n＝5只每组施用LNP的单次剂量且在给药后四小时收集血液用于血清细胞因子分析。在给药后6天，在尸检时收集肝用于编辑效率的NGS测量。在此研究中，sgRNA中的每一个靶向TTR或FVII基因中的相同序列，其中各基因的一个sgRNA仅具有末端修饰，对于FVII为G000208SEQIDNO：286，对于TTR为G000209，两者分别在sgRNA的5’及3’末端处的三个末端核苷酸处及之间具有2’-O-甲基修饰及硫代磷酸酯键，且第二个sgRNA与对于FVII之前述体内研究中的G000267、G000282及G000283G000373SEQIDNO：287；对于TTR的G000267SEQIDNO：234具有相同的修饰模式。如图19A至19D中所示，sgRNA中的每一个对于测试的细胞因子中的每一个以剂量依赖性方式产生类似反应。对于编辑效率，相比于较少修饰的形式G000208SEQIDNO：286，靶向FVII的在更大程度上修饰的sgRNAG000373SEQIDNO：287的编辑效率在测试的剂量中的每一个中增加图18A。也对于靶向TTR的sgRNA观测到这些结果图20A至20B。在另一体内研究中，测试另外十个与G000282靶向小鼠TTR基因中的相同序列的sgRNA。G000282也包括于研究中用于比较目的。以1mgkg或0.5mgkg向小鼠n＝5只每组施用LNP的单次剂量。使用上文所述的LNP配制方案B配制用于此研究中的LNP。给药后七7天，在尸检时收集肝及血液分别用于编辑效率的NGS测量及血清TTR分析。在此研究中，sgRNA中的每一个靶向TTR基因中的相同序列。测试的各sgRNA的修饰模式变化且包括sgRNA的5’末端区、3’末端区、发夹1区、发夹2区、连接区、下部茎区、突起区及上部茎区中的2’-OMe、2'-F及PS修饰。此研究的结果显示于图22A至22C中，包括编辑％图22A、平均编辑及标准差图22B及血清TTR水平图22C。根据本文所描述的方法在初生小鼠肝细胞中测试这些相同sgRNA。此剂量反应TTR编辑研究的结果显示于图24A至24C中，包括编辑％图24A、剂量反应曲线图24B及EC50值图24C。在另一体内研究中，测试另外十三个与G000282靶向小鼠TTR基因中的相同序列的sgRNA。G000282也包括于研究中用于比较目的。以1mgkg向小鼠n＝5只每组施用LNP的单次剂量。使用上文所述的LNP配制方案C配制用于此研究中的LNP。用于此研究中的Cas9mRNA具有SEQIDNO：359的序列。在给药后四小时收集血液用于血清细胞因子分析。在给药后7天，在尸检时收集肝及血液分别用于编辑效率的NGS测量及血清TTR分析。在此研究中，sgRNA中的每一个靶向TTR基因中的相同序列。测试的sgRNA包括sgRNA的5’末端区、3’末端区、发夹1区、发夹2区及上部茎区中的额外2'-OMe及PS修饰。此研究的结果显示于图23A-23C中，包括编辑％图23A、平均编辑％图23B及血清TTR水平图23C。

权利要求：1.单指导RNA，其包含5’端修饰及以下一个或多个中的一个或多个修饰：a.上部茎区；b.发夹1区；及c.发夹2区，其中5’端修饰在5’末端的5’端处的前七个核苷酸内包含至少两个硫代磷酸酯PS键。2.如权利要求1的sgRNA，其中至少一个修饰包含2’-O-甲基2’-O-Me修饰的核苷酸。3.如权利要求1或权利要求2的sgRNA，其中至少一个修饰包含2’-氟2’-F修饰的核苷酸。4.如权利要求1至3中任一项的sgRNA，其中至少一个修饰包含核苷酸之间的硫代磷酸酯PS键。5.如权利要求1至4中任一项的sgRNA，其中sgRNA包含上部茎区中的一个或多个修饰。6.如权利要求5的sgRNA，其包含US1至US12处的修饰。7.如权利要求1至6中任一项的sgRNA，其中sgRNA包含发夹1区中的一个或多个修饰。8.如权利要求7的sgRNA，其中sgRNA包含H1-1处的修饰。9.如权利要求1至8中任一项的sgRNA，其中sgRNA包含发夹2区中的一个或多个修饰。10.如权利要求9的sgRNA，其中sgRNA包含H2-1处的修饰。11.如权利要求1至10中任一项的sgRNA，其中sgRNA包含H1-1至H1-12处的修饰。12.如权利要求1至11中任一项的sgRNA，其中sgRNA包含H2-1至H2-15处的修饰。13.如权利要求1至12中任一项的sgRNA，其中sgRNA包含上部茎区、发夹1区及发夹2区中的每一个中的一个或多个修饰。14.如权利要求1至13中任一项的sgRNA，其中sgRNA包含发夹1区与发夹2区之间的经修饰的核苷酸。15.如权利要求1至14中任一项的sgRNA，其进一步包含含有修饰的下部茎区。16.如权利要求1至15中任一项的sgRNA，其进一步包含含有修饰的3’末端区。17.如权利要求16的sgRNA，其进一步包含3’末端中的3’端修饰。18.如权利要求17的sgRNA，其中3’末端的3’端处的最后四个核苷酸中的至少两者经修饰。19.如权利要求17的sgRNA，其中3’末端的3’端处的最后四个核苷酸中的至少两者经2’-O-Me、2’-F或2’-O-moe修饰。20.如权利要求17至19中任一项的sgRNA，其进一步包含3’末端的3’端处的最后四个核苷酸中的一个或多个之间的硫代磷酸酯PS键。21.如权利要求1至20中任一项的sgRNA，其进一步包含含有修饰的突起区。22.如权利要求1至21中任一项的sgRNA，其进一步包含含有修饰的连接区。23.如权利要求1至22中任一项的sgRNA，其中5’末端的5’端处的至少前三个核苷酸及3’末端的3’端处的最后三个核苷酸经修饰。24.如权利要求1至23中任一项的sgRNA，其中5’末端的5’端处的前四个核苷酸及3’末端的3’端处的最后四个核苷酸与硫代磷酸酯PS键连接。25.如权利要求24的sgRNA，其中端修饰包含2’-O-Me。26.如权利要求24的sgRNA，其中端修饰包含2’-F。27.如权利要求1至26中任一项的sgRNA，其中5’末端的5’端处的前四个核苷酸及3’末端的3’端处的最后四个核苷酸与PS键连接，且其中5’末端的5’端处的前三个核苷酸及3’末端的3’端处的最后三个核苷酸包含2’-O-Me修饰。28.如权利要求1至26中任一项的sgRNA，其中5’末端处的前四个核苷酸及3’末端处的最后四个核苷酸与PS键连接，且其中5’末端处的前三个核苷酸及3’末端处的最后三个核苷酸包含2’-O-Me、2’-F及或2’-O-moe修饰。29.如权利要求1至28中任一项的sgRNA，其中LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及或LS12经2’-O-Me修饰。30.如权利要求1至29中任一项的sgRNA，其中突起区核苷酸中的每一个经2’-O-Me修饰。31.如权利要求1至29中任一项的sgRNA，其中突起区核苷酸中的至少50％经2’-O-Me修饰。32.如权利要求1至31中任一项的sgRNA，其中上部茎区核苷酸中的每一个经2’-O-Me修饰。33.如权利要求1至32中任一项的sgRNA，其中连接区中的N16、N17及或N18经2’-O-Me修饰。34.如权利要求1至32中任一项的sgRNA，其中连接区中的N15、N16、N17及或N18经修饰。35.如权利要求33或权利要求34的sgRNA，其中连接区中的修饰选自2’-O-Me及2’F。36.如权利要求32至35中任一项的sgRNA，其中N16、N17及N18与PS键连接。37.如权利要求1至36中任一项的sgRNA，其中发夹1区核苷酸中的每一个经2’-O-Me修饰。38.如权利要求1至37中任一项的sgRNA，其中发夹2区核苷酸中的每一个经2’-O-Me修饰。39.单指导RNAsgRNA，其包含以下位置处的2’-O-Me修饰核苷酸：a.5’末端的5’端处的前三个核苷酸；b.下部茎区中的LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及或LS12；c.突起区中的B1及或B2；d.上部茎区中的各核苷酸；e.连接区中的N16、N17及或N18；f.发夹1区中的各核苷酸；g.发夹2区中的各核苷酸；及h.3’末端处的最后四个核苷酸。40.如权利要求39的sgRNA，其中B3至B6经2’-O-Me修饰。41.如权利要求39的sgRNA，其进一步包含三个连接5’末端的5’端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端的3’端处的最后四个核苷酸的PS键。42.如前述权利要求中任一项的sgRNA，其中LS9及LS10例如经2’-F或2’-OMe修饰。43.如前述权利要求中任一项的sgRNA，其中N15、N16、N17及N18例如经2’-F或2’-OMe修饰。44.如前述权利要求中任一项的sgRNA，其中H2-9、H2-10、H2-11、H2-12、H2-13、H2-14及H2-15经2’-F修饰。45.如前述权利要求中任一项的sgRNA，其中3’末端处的倒数第二个、倒数第三个及倒数第四个核苷酸经2’-F修饰。46.单指导RNAsgRNA，其包含以下位置处的2’-F修饰核苷酸：a.下部茎区中的LS9及LS10；b.连接区中的N15、N16、N17及N18；及c.发夹2区中的H2-9、H2-10、H2-11、H2-12、H2-13、H2-14及H2-15。47.如权利要求46的sgRNA，其进一步包含3’末端处的倒数第二个、倒数第三个及倒数第四个核苷酸处的2’-F修饰核苷酸。48.如权利要求46或权利要求47的sgRNA，其进一步包含三个连接5’末端的5’端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端的3’端处的最后四个核苷酸的PS键。49.如权利要求46至48中任一项的sgRNA，其进一步包含5’末端的5’端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me或2’-F修饰核苷酸及3’末端的3’端处的最后四个核苷酸中的三个处的2’-O-Me或2’-F修饰核苷酸。50.单指导RNAsgRNA，其包含：a.5’末端的5’端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸；b.US1至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；c.H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；d.H2-1至H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；及e.3’末端的3’端处的最后四个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸。51.如权利要求50的sgRNA，其进一步包含LS1及或LS6处的2’-O-Me修饰核苷酸。52.如权利要求50或权利要求51的sgRNA，其进一步包含发夹1区与发夹2区之间的2’-O-Me修饰核苷酸。53.单指导RNAsgRNA，其包含：a.5’末端的5’端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸；b.LS1至LS6处的2’-F修饰核苷酸；c.US1至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；d.H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；e.发夹1区与发夹2区之间的2’-O-Me修饰核苷酸；f.H2-1至H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；及g.3’末端的3’端处的最后四个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸。54.单指导RNAsgRNA，其包含：a.5’末端的5’端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸；b.LS2至LS5处的2’-F修饰核苷酸；c.LS1及LS6处的2’-O-Me修饰核苷酸；d.US1至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；e.H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；f.发夹1区与发夹2区之间的2’-O-Me修饰核苷酸；g.H2-1至H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；及h.3’末端的3’端处的最后四个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸。55.单指导RNAsgRNA，其包含a.5’末端的5’端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸；b.US1至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；c.LS7、LS8、LS11及LS12处的2’-O-Me修饰核苷酸；d.H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；e.发夹1区与发夹2区之间的2’-O-Me修饰核苷酸；f.H2-1至H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；及g.3’末端的3’端处的最后四个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸。56.单指导RNAsgRNA，其包含a.5’末端的5’端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸；b.US1至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；c.LS7、LS8、LS11及LS12处的2’-O-Me修饰核苷酸；d.LS9及LS10处的2’-F修饰核苷酸；e.H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；f.发夹1区与发夹2区之间的2’-O-Me修饰核苷酸；g.H2-1至H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；及h.3’末端的3’端处的最后四个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸。57.单指导RNAsgRNA，其包含a.5’末端的5’端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸；b.US1至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；c.LS8、LS10及LS12处的2’-O-Me修饰核苷酸；d.LS7、LS9及LS11处的2’-O-F修饰的核苷酸；e.H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；f.发夹1区与发夹2区之间的2’-O-Me修饰核苷酸；g.H2-1至H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；及h.3’末端的3’端处的最后四个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸。58.单指导RNAsgRNA，其包含：a.5’末端的5’端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸；b.LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12处的2’-O-Me修饰核苷酸c.US1至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；d.H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；e.发夹1区与发夹2区之间的2’-O-Me修饰核苷酸；f.H2-1至H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；及g.3’末端的3’端处的最后四个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸。59.单指导RNAsgRNA，其包含a.5’末端的5’端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸；b.LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12处的2’-O-Me修饰核苷酸；c.LS9及LS10处的2’-F修饰核苷酸；d.US1至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；e.H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；f.发夹1区与发夹2区之间的2’-O-Me修饰核苷酸；g.H2-1至H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；及h.3’末端的3’端处的最后四个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸。60.单指导RNAsgRNA，其包含a.5’末端的5’端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸；b.US1至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；c.H1-1至H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；d.发夹1区与发夹2区之间的2’-O-Me修饰核苷酸；e.H2-1至H2-8处的2’-O-Me修饰核苷酸；f.H2-9至H2-15处的2’-F修饰核苷酸；g.3’末端处的倒数第二个、倒数第三个及倒数第四个核苷酸处的2’-F修饰核苷酸；及h.3’末端的3’端处的最后一个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸。61.单指导RNAsgRNA，其包含a.5’末端的5’端处的前三个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸；b.US1至US12处的2’-O-Me修饰核苷酸；c.H1-2、H1-4、H1-6、H1-8、H1-10及H1-12处的2’-O-Me修饰核苷酸；d.H1-1、H1-3、H1-5、H1-7、H1-9及H1-11处的2’-F修饰核苷酸；e.发夹1区与发夹2区之间的2’-F修饰核苷酸；f.H2-2、H2-4、H2-6、H2-8、H2-10、H2-12及H2-14处的2’-F修饰核苷酸；g.H2-1、H2-3、H2-5、H2-7、H2-9、H2-11、H2-13及H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；h.3’末端处的倒数第二个及倒数第四个核苷酸处的2’-F修饰核苷酸；及i.3’末端的3’端处的倒数第三个及最后一个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸。62.如权利要求50至61中任一项的sgRNA，其进一步包含三个连接5’末端的5’端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端的3’端处的最后四个核苷酸的PS键。63.如权利要求50至61中任一项的sgRNA，其进一步包含5’末端的5’端处的前七个核苷酸内的至少一个硫代磷酸酯PS键。64.单指导RNAsgRNA，其包含a.LS8、LS10、LS12、H1-2、H1-4、H1-6、H1-8、H1-10、H1-12、H2-1、H2-3、H2-5、H2-7、H2-9、H2-11、H2-13及H2-15处的2’-O-Me修饰核苷酸；及b.LS7、LS9、LS11；H1-1、H1-3、H1-5、H1-7、H1-9、H1-11、H1-13、H2-2、H2-4、H2-6、H2-8、H2-10、H2-12及H2-14处的2’-F修饰核苷酸。65.如权利要求64的sgRNA，其进一步包含三个连接5’末端的5’端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端的3’端处的最后四个核苷酸的PS键。66.如权利要求64或权利要求65的sgRNA，其进一步包含a.3’末端的3’端处的最后一个及倒数第三个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸；及b.3’末端的3’端处的倒数第二个及倒数第四个核苷酸处的2’-F修饰核苷酸。67.包含SEQIDNo:228至332中任一个的sgRNA，其包括表4的修饰。68.包含SEQIDNo:235至240、265至285及309至329中任一个的sgRNA，其包括表4的修饰。69.sgRNA，其包含SEQIDNo:240。70.包含SEQIDNo:240的sgRNA，其包括表4的修饰。71.包含SEQIDNo:242的sgRNA，其包括表4的修饰。72.sgRNA，其包含SEQIDNo:242的修饰，如表4中所示。73.sgRNA，其包含SEQIDNo:358。74.sgRNA，其包含与SEQIDNo:235至240、265至285及309至329中任一个的核酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70％同一性的核酸，其中对应于表4中参考序列标识符的核苷酸的sgRNA的各核苷酸处的修饰与表4中的参考序列标识符中示出的修饰相同或等效。75.如权利要求66至74中任一项的sgRNA，其进一步包含三个连接5’末端处的前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端处的最后四个核苷酸的PS键。76.如权利要求1至74中任一项的sgRNA，其进一步包含至少三个连接发夹1区中的核苷酸的PS键。77.如权利要求1至75中任一项的sgRNA，其进一步包含至少三个连接发夹2区中的核苷酸的PS键。78.如权利要求1至76中任一项的sgRNA，其进一步包含至少三个连接上部茎区中的核苷酸的PS键。79.如权利要求1至77中任一项的sgRNA，其中sgRNA与酿脓链球菌Cas9形成核糖核蛋白复合体。80.指导RNA，其包含上部茎区中的各核苷酸处的2’-O-Me修饰。81.指导RNA，其包含以下核苷酸中的一、二、三或四、五、六、七、八、九、十或十一个处的2’-O-Me修饰：US1、US2、US3、US4、US5、US6、US7、US8、US9、US10、US11及US12。82.指导RNA，其包含发夹1区及发夹2区核苷酸中50％或大于50％处的2’-O-Me修饰。83.指导RNA，其包含上部茎区中的各核苷酸处的2’-O-Me修饰以及发夹1区及发夹2区核苷酸中50％或大于50％处的2’-O-Me修饰。84.指导RNA，其包含起始于H2-1或H2-2处的各核苷酸至3’末端的最后一个核苷酸处的2’-O-Me修饰，或由起始于H2-1或H2-2处的各核苷酸至3’末端的最后一个核苷酸处的2’-O-Me修饰组成。85.指导RNA，其包含LS1及或LS6处的2’-O-Me修饰及LS2至LS5处无修饰，或由LS1及或LS6处的2’-O-Me修饰及LS2至LS5处无修饰组成。86.指导RNA，其包含LS8、LS9、LS10、LS11及或LS12中的2个或大于2个处的2’-O-Me修饰核苷酸。87.如权利要求85的指导RNA，其中至少LS8及LS10经2’-O-Me修饰。88.如权利要求79至86中任一项的指导RNA，其进一步包含连接区中核苷酸中50％或大于50％处的2’-O-Me修饰。89.如权利要求87的指导RNA，其中连接区核苷酸中的至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％经2’-O-Me修饰。90.指导RNA，其包含连接区中至多50％核苷酸处的2’-O-Me修饰。91.指导RNA，其包含连接区中四个或大于四个核苷酸处的2’-O-Me修饰。92.如权利要求90的指导RNA，其中连接区中核苷酸N2至N6中的至少一个、两个、三个、四个或五个经2’-O-Me修饰。93.指导RNA，其包含连接区中十个或大于十个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸。94.如权利要求92的指导RNA，其中至少N2至N6经2’-O-Me修饰。95.指导RNA，其包含突起区中核苷酸中50％或大于50％处的2’-O-Me修饰。96.如权利要求94的指导RNA，其中突起区核苷酸中的至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％经2’-O-Me修饰。97.如权利要求94的指导RNA，其中B2、B3及或B4经2’-O-Me修饰。98.指导RNA，其包含突起区中的三个或大于三个核苷酸处的2’-O-Me修饰核苷酸。99.如权利要求97的指导RNA，其中B2、B3及或B4经2’-O-Me修饰。100.包含SEQIDNO:357核苷酸的指导RNA，其具有如前述权利要求中任一项的指导RNA的修饰模式。101.包含SEQIDNO:356核苷酸的指导RNA，其具有如前述权利要求中任一项的指导RNA的修饰模式。102.如权利要求79至100中任一项的指导RNA，其进一步包含5’末端区的5’端处前三个、四个或五个核苷酸处的2’-O-Me修饰。103.如权利要求79至100中任一项的指导RNA，其进一步包含3’末端区的3’端处最后三个、最后四个或最后五个核苷酸处的2’-O-Me修饰。104.如权利要求102的指导RNA，其中3’末端区的3’端处最后一个核苷酸未经修饰。105.如权利要求102的指导RNA，其中仅3’末端区的3’端处倒数第二个及倒数第三个核苷酸经修饰。106.如权利要求102的指导RNA，其中仅3’末端区中倒数第二个、倒数第三个及倒数第四个核苷酸经修饰。107.如权利要求79至100中任一项的指导RNA，其进一步包含5’末端的5’端处前三个、四个或五个核苷酸之间的PS键。108.如权利要求106的指导RNA，其中5’末端的5’端处前四个核苷酸与PS键连接。109.如权利要求79至100中任一项的指导RNA，其进一步包含3’末端的3’端处最后三个、四个或五个核苷酸之间的PS键。110.如权利要求108的指导RNA，其中3’末端的3’端处最后四个核苷酸与PS键连接。111.如权利要求79至100中任一项的指导RNA，其中5’末端的5’端处前三个或四个核苷酸及3’末端的3’端处的最后三个或四个核苷酸包含2’-O-Me修饰。112.如权利要求79至100中任一项的指导RNA，其中5’末端的5’端处前三个或四个核苷酸与PS键连接，且3’末端的3’端处最后三个或四个核苷酸与PS键连接。113.如权利要求79至100中任一项的指导RNA，其中5’末端的5’端处前三个或四个核苷酸包含2’-O-Me修饰且与PS键连接，及3’末端的3’端处最后三个或四个核苷酸包含2’-O-Me修饰且与PS键连接。114.如权利要求79至100中任一项的指导RNA，其中核苷酸LS8、LS9、LS10、LS11及LS12中的至少两者包含2’-O-Me修饰。115.如权利要求79至100中任一项的指导RNA，其中至少LS8及LS10经2’-O-Me修饰。116.如权利要求79至100中任一项的指导RNA，其中连接区核苷酸中的至少50％经2’-O-Me修饰。117.如权利要求115的指导RNA，其中连接区核苷酸中的至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％经2’-O-Me修饰。118.如权利要求115的指导RNA，其中至少N2至N6经2’-O-Me修饰。119.如权利要求79至100中任一项的指导RNA，其中连接区核苷酸中的至少十个经2’-O-Me修饰。120.如权利要求115的指导RNA，其中至少N2至N6经2’-O-Me修饰。121.如权利要求79至100中任一项的指导RNA，其中突起区核苷酸中的至少50％经2’-O-Me修饰。122.如权利要求120的指导RNA，其中突起区核苷酸中的至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％经2’-O-Me修饰。123.如权利要求121的指导RNA，其中B2、B3及或B4经2’-O-Me修饰。124.如权利要求79至100中任一项的指导RNA，其中突起区核苷酸中的至少三个经2’-O-Me修饰。125.如权利要求123的指导RNA，其中B2、B3及或B4经2’-O-Me修饰。126.如权利要求79至124中任一项的指导RNA，其中指导RNA为sgRNA。127.如权利要求79至125中任一项的指导RNA，其中指导RNA为dgRNA。128.如权利要求81或82的指导RNA，其中发夹1区及发夹2区核苷酸中的至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％经2’-OMe修饰。129.如权利要求79至127中任一项的指导RNA，其中sgRNA与酿脓链球菌Cas9形成核糖核蛋白复合体。130.单指导RNAsgRNA，其包含以下处的2’-O-Me修饰核苷酸或由以下处的2’-O-Me修饰核苷酸组成：a.5’末端的5’端处前三个核苷酸；b.上部茎区中的各核苷酸；c.发夹1区中的各核苷酸；d.发夹1区与发夹2区之间的核苷酸；e.发夹2区中的各核苷酸；及f.3’末端的3’端处的最后四个核苷酸。131.如权利要求129的sgRNA，其进一步包含连接5’末端的5’端处前四个核苷酸的PS键及连接3’末端的3’端处最后四个核苷酸的PS键。132.具有如SEQIDNO:350、351、352或353所示的修饰模式的sgRNA，如表4中所示。133.单指导RNAsgRNA，其包含以下处的2’-O-Me修饰核苷酸或由以下处的2’-O-Me修饰核苷酸组成：a.5’末端的5’端处前三个、四个、五个或七个核苷酸；b.上部茎区中的各核苷酸；c.发夹1区中的各核苷酸；d.发夹1区与发夹2区之间的核苷酸；e.发夹2区中的各核苷酸；及f.3’末端的3’端处最后四个核苷酸。134.单指导RNAsgRNA，其包含以下处的2’-O-Me修饰核苷酸或由以下处的2’-O-Me修饰核苷酸组成：a.5’末端的5’端处前三个、四个、五个或七个核苷酸；b.核苷酸US1、US2、US3、US4、US5、US6、US7、US8、US9、US10、US11及US12中的每一个；c.核苷酸H1-1、H1-2、H1-3、H1-4、H1-5、H1-6、H1-7、H1-8、H1-9、H1-10、H1-11及H1-12中的每一个；d.发夹1区与发夹2区之间的核苷酸；e.核苷酸H2-1、H2-2、H2-3、H2-4、H2-5、H2-6、H2-7、H2-8、H2-9、H2-10、H2-11、H2-12、H2-13、H2-14及H2-15中的每一个；及f.3’末端的3’端处最后四个核苷酸。135.如权利要求129至133中任一项的sgRNA，其进一步包含连接5’末端的5’端处前四个核苷酸的PS键及连接3’末端的3’端处最后四个核苷酸的PS键。136.sgRNA，其具有如表4中所示的SEQIDNO:350、351、352或353的修饰模式。137.如权利要求129至135中任一项的sgRNA，其中sgRNA与酿脓链球菌Cas9形成核糖核蛋白复合体。138.crisprRNAcrRNA，其包含以下区中的一个或多个中的一个或多个修饰：a.5’末端的5’端处前五个核苷酸；b.下部茎区；c.突起区；d.上部茎区；及e.crRNA的3’端处最后五个核苷酸。139.如权利要求136的crRNA，其进一步包含5’端修饰，其中5’端修饰包含5’末端的5’端处前七个核苷酸内的一个或多个硫代磷酸酯键。140.如权利要求136的crRNA，其进一步包含5’端修饰，其中5’端修饰包含5’末端的5’端处前七个核苷酸内的至少两个硫代磷酸酯键。141.如权利要求137至139中任一项的crRNA，其中至少一个修饰包含2’-O-甲基2’-O-Me修饰的核苷酸。142.如权利要求137至140中任一项的crRNA，其中至少一个修饰包含2’-氟2’-F修饰的核苷酸。143.如权利要求137至141中任一项的crRNA，其中至少一个修饰包含核苷酸之间的硫代磷酸酯PS键。144.如权利要求137至142中任一项的crRNA，其中5’末端的5’端处前三个核苷酸及3’末端的3’端处最后三个核苷酸经修饰。145.如权利要求137至143中任一项的crRNA，其中5’末端的5’端处前四个核苷酸及3’末端的3’端处最后四个核苷酸与硫代磷酸酯PS键连接。146.如权利要求143的crRNA，其中修饰包含2’-O-Me。147.如权利要求143的crRNA，其中修饰包含2’-F。148.如权利要求137至146中任一项的crRNA，其中5’末端的5’端处前四个核苷酸及3’末端的3’端处最后四个核苷酸与PS键连接，且其中5’末端的5’端处前三个核苷酸及3’末端的3’端处最后三个核苷酸包含2’-O-Me修饰。149.如权利要求137至146中任一项的crRNA，其中5’末端的5’端处前四个核苷酸及3’末端的3’端处最后四个核苷酸与PS键连接，且其中5’末端的5’端处前三个核苷酸及3’末端的3’端处最后三个核苷酸包含2’-F修饰。150.如权利要求137至148中任一项的crRNA，其中LS1及LS6经2’-O-Me修饰。151.如权利要求137至149中任一项的crRNA，其中上部茎区核苷酸中的每一个经2’-O-Me修饰。152.crisprRNAcrRNA，其包含以下处的2’-O-Me修饰核苷酸：a.下部茎区中的LS1及LS6；及b.上部茎区中的各核苷酸。153.如权利要求151的crRNA，其进一步包含三个连接5’末端的5’端处前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端的3’端处最后四个核苷酸的PS键。154.如权利要求151或权利要求152的crRNA，其进一步包含5’末端的5’端处前三个核苷酸处的2’-O-Me或2’-F修饰核苷酸及3’末端的3’端处最后三个核苷酸处的2’-O-Me或2’-F修饰核苷酸。155.如权利要求137至153中任一项的crRNA，其中LS1、LS2及LS6经2’-F修饰。156.如权利要求137至154中任一项的crRNA，其中突起区中的各核苷酸经2’-F修饰。157.crisprRNAcrRNA，其包含以下处的2’-F修饰核苷酸：a.下部茎区中的LS1、LS2及LS6；及b.突起区中的各核苷酸。158.如权利要求137至156中任一项的crRNA，其进一步包含三个连接5’末端的5’端处前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端的3’端处最后四个核苷酸的PS键。159.如权利要求137至157中任一项的crRNA，其进一步包含5’末端的5’端处前三个核苷酸处的2’-O-Me或2’-F修饰核苷酸及3’末端的3’端处最后三个核苷酸处的2’-O-Me或2’-F修饰核苷酸。160.包含SEQIDNo:1至187中任一个的crRNA，其包括表4的修饰。161.包含SEQIDNo:19至31、53至73、104至130及161至187中任一个的crRNA，其包括表4的修饰。162.crRNA，其包含与SEQIDNo:19至31、53至73、104至130及161至187中任一个具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70％同一性的核酸，其中对应于表4中参考序列标识符的核苷酸的crRNA的各核苷酸处的修饰与表4中的参考序列标识符中示出的修饰相同或等效。163.如权利要求159至161中任一项的crRNA，其进一步包含三个连接5’末端的5’端处前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端的3’端处最后四个核苷酸的PS键。164.如权利要求137至162中任一项的crRNA，其中与trRNA组合的crRNA与酿脓链球菌Cas9形成核糖核蛋白复合体。165.tracrRNAtrRNA，其包含以下区中的一个或多个中的一个或多个修饰：a.5’末端的5’端处前五个核苷酸；b.上部茎区；c.突起区；d.下部茎区；e.连接区；f.发夹1区；g.发夹2区；及h.3’末端的3’端处最后五个核苷酸。166.如权利要求164的trRNA，其中至少一个修饰包含2’-O-甲基2’-O-Me修饰的核苷酸。167.如权利要求164或权利要求165的trRNA，其中至少一个修饰包含2’-氟2’-F修饰的核苷酸。168.如权利要求164至166中任一项的trRNA，其中至少一个修饰包含核苷酸之间的硫代磷酸酯PS键。169.如权利要求164至167中任一项的trRNA，其中5’末端的5’端处前四个核苷酸及3’末端的3’端处最后四个核苷酸与硫代磷酸酯PS键连接。170.如权利要求164至168中任一项的trRNA，其中5’末端的5’端处前三个核苷酸及3’末端的3’端处最后三个核苷酸经修饰。171.如权利要求169的trRNA，其中修饰包含2’-O-Me。172.如权利要求169的trRNA，其中修饰包含2’-F。173.如权利要求164至171中任一项的trRNA，其中5’末端的5’端处前四个核苷酸及3’末端的3’端处最后四个核苷酸与PS键连接，且其中5’末端的5’端处前三个核苷酸及3’末端的3’端处最后三个核苷酸包含2’-O-Me修饰。174.如权利要求164至171中任一项的trRNA，其中5’末端的5’端处前四个核苷酸及3’末端的3’端处最后四个核苷酸与PS键连接，且其中5’末端的5’端处前三个核苷酸及3’末端的3’端处最后三个核苷酸包含2’-F修饰。175.如权利要求164至173中任一项的trRNA，其中上部茎区中的各核苷酸经2’-O-Me修饰。176.如权利要求164至174中任一项的trRNA，其中突起区内的B1及B2经2’-O-Me修饰。177.如权利要求164至175中任一项的trRNA，其中连接区中的N3、N4、N5、N15、N16、N17及或N18经2’-O-Me修饰。178.如权利要求164至176中任一项的trRNA，其中发夹1区中的各核苷酸经2’-O-Me修饰。179.如权利要求164至177中任一项的trRNA，其中发夹2区中的各核苷酸经2’-O-Me修饰。180.tracrRNAtrRNA，其包含以下处的2’-O-Me修饰核苷酸：a.上部茎区中的各核苷酸；b.突起区内的B1及或B2；c.连接区中的N3、N4、N5、N15、N16、N17及或N18；d.发夹1区中的各核苷酸；及e.发夹2区中的各核苷酸。181.如权利要求179的trRNA，其进一步包含三个连接5’末端的5’端处前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端的3’端处最后四个核苷酸的PS键。182.如权利要求179或权利要求180的trRNA，其进一步包含5’末端的5’端处前三个核苷酸处的2’-O-Me或2’-F修饰核苷酸及3’末端的3’端处最后三个核苷酸处的2’-O-Me或2’-F修饰的核酸。183.如权利要求164至181中任一项的trRNA，其中N15、N16、N17及N18经2’-F修饰。184.如权利要求164至182中任一项的trRNA，其中LS1、LS3及LS5经2’-F修饰，且LS2、LS4及LS6经2’-O-Me修饰。185.如权利要求164至183中任一项的trRNA，其进一步包含三个连接5’末端的5’端处前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端的3’端处最后四个核苷酸的PS键。186.如权利要求164至184中任一项的trRNA，其进一步包含5’末端的5’端处前三个核苷酸处的2’-O-Me或2’-F修饰核苷酸及3’末端的3’端处最后三个核苷酸处的2’-O-Me或2’-F修饰核苷酸。187.包含SEQIDNo:188至227中任一个的trRNA，其包括表4的修饰。188.trRNA，其包含与SEQIDNo:188至227中任一个具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70％同一性的核酸，其中对应于表4中参考序列标识符的核苷酸的trRNA的各核苷酸处的修饰与表4中的参考序列标识符中示出的修饰相同或等效。189.如权利要求186至187中任一项的trRNA，其进一步包含三个连接5’末端的5’端处前四个核苷酸的硫代磷酸酯PS键及三个连接3’末端的3’端处最后四个核苷酸的PS键。190.如权利要求164至188中任一项的trRNA，其中与crRNA组合的trRNA与酿脓链球菌Cas9形成核糖核蛋白复合体。191.包含crRNA及trRNA的双指导，其中crRNA包含如表4中所示的SEQIDNo:1至187中任一个，且其中trRNA包含如表4中所示的SEQIDNo:188至227中任一个的核酸。192.双指导，其包含如权利要求137至163中任一项的crRNA及如权利要求164至189中任一项的trRNA。193.双指导，其包含如权利要求137至163中任一项的crRNA及未经修饰的trRNA。194.双指导，其包含未经修饰的crRNA及如权利要求137至189中任一项的trRNA。195.如权利要求190至193中任一项的双指导，其中双指导与酿脓链球菌Cas9形成核糖核蛋白复合体。196.LNP组合物，其包含如权利要求1至78及129至136中任一项的sgRNA。197.包含gRNA的LNP组合物，gRNA包含如权利要求1至193中任一项的RNA或由如权利要求1至193中任一项的RNA组成。198.组合物，其包含与脂质纳米颗粒lipidnanoparticle；LNP联合的如权利要求1至78及129至136中任一项的sgRNA。199.组合物，其包含与脂质纳米颗粒LNP联合的如权利要求137至163中任一项的crRNA。200.组合物，其包含与脂质纳米颗粒LNP联合的如权利要求164至189中任一项的trRNA。201.组合物，其包含如权利要求1至78及129至136中任一项的sgRNA、如权利要求79至128中任一项的gRNA、如权利要求137至163中任一项的crRNA、如权利要求164至189中任一项的trRNA、如权利要求190至194中任一项的dgRNA或如权利要求195至199中任一项的组合物，其进一步包含核酸酶或编码核酸酶的mRNA。202.如权利要求200的组合物，其中核酸酶为Cas蛋白质。203.如权利要求201的组合物，其中Cas蛋白质为Cas9。204.如权利要求202的组合物，其中Cas9为酿脓链球菌S.pyogenesCas9。205.如权利要求200至203中任一项的组合物，其中核酸酶为切口酶nickase。206.如权利要求200至204中任一项的组合物，其中核酸酶是经修饰的核酸酶。207.如权利要求205的组合物，其中经修饰的核酸酶包含核定位信号nuclearlocalizationsignal；NLS。208.如权利要求200至206中任一项的组合物，其包含编码核酸酶的mRNA。209.药物制剂，其包含如权利要求1至78及129至136中任一项的sgRNA、如权利要求79至128中任一项的gRNA、如权利要求137至163中任一项的crRNA、如权利要求164至189中任一项的trRNA、如权利要求190至194中任一项的dgRNA或如权利要求195至207中任一项的组合物及可药用载体。210.修饰标靶DNA的方法，其包含将Cas蛋白质或编码Cas蛋白质的核酸及以下中的任何一个或多个递送至细胞：a.如权利要求1至78及129至136中任一项的sgRNA；b.如权利要求79至128中任一项的gRNA；c.如权利要求137至163中任一项的crRNA；d.如权利要求164至189中任一项的trRNA；e.如权利要求190至194中任一项的dgRNA；f.如权利要求195至207中任一项的组合物；或g.如权利要求208的药物制剂。211.如权利要求209的方法，其中方法导致在基因中产生插入或缺失。212.如权利要求209的方法，其进一步包含向细胞递送模板，其中模板至少一部分并入至经以Cas蛋白质所诱发的双链断裂位点处或靠近处的标靶DNA中。213.如权利要求1至78及129至136中任一项的sgRNA，其用于制备用于治疗疾病或病症的药物。214.如权利要求737至163中任一项的crRNA，其用于制备用于治疗疾病或病症的药物。215.如权利要求164至189中任一项的trRNA，其用于制备用于治疗疾病或病症的药物。216.如权利要求137至163中任一项的crRNA与如权利要求164至189中任一项的trRNA的组合，其用于制备用于治疗疾病或病症的药物。217.如权利要求208的药物制剂，其用于制备用于治疗疾病或病症的药物。

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