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申请/专利权人：江南大学

摘要：一种利用重组Escherichia coli全细胞转化AD生成ADD的方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明首先获得新金色分枝杆菌中3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶KSDD的基因扩增，然后利用pET28a质粒，实现了该基因在模式菌株大肠杆菌BL21中的过量表达。本发明构建以4‑AD为底物全细胞转化为方法的高产ADD的大肠杆菌工程菌株，对该菌株的酶活力及发酵性能进行研究发现3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶的活力较出发菌株有了明显提高，以0.1％wv4‑AD为底物，全细胞转化10h，底物摩尔转化率达到76.5％，是出发菌株相对转化率的25倍。本发明为微生物一步发酵法生产ADD的工业化提供了有益的指导。

主权项：一种重组表达载体pET28a‑ksdD，其特征是：通过PCR技术获得来源于新金色分枝杆菌的KSDD基因与表达载体pET28a连接获得。

全文数据：_种利用重组Escherichiacoli全细胞转化AD生成ADD的方法技术领域[0001] 一种利用重组Escherichiacoli全细胞转化AD生成ADD的方法，属于基因工程和酶工程领域。技术背景[0002]留体药物可通过全合成或对天然留体化合物的降解和其官能团的转化获得，甾体药物具有很强的抗感染、刚过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。随着时代的不断发展，甾体药物已经成为仅次于抗生素的第二大类药物，2000年留体药物在全球药物市场的销售额已突破200亿美元，约占世界医药总销售额的6%。[0003]留体激素类药物分类:肾上腺皮质激素，包括氢化可的松，强的松等。可治疗阿狄森氏症，抗炎，抗过敏，抗休克的等;蛋白同化激素，其主要生理功能是抑制蛋白异化和促进蛋白合成，主要用于治疗蛋白质增加和合成不足引起的疾病;性激素，包括雌性激素、雄性激素和孕激素。[0004] 早期合成留体药物的原料大多从动物组织液中直接提取，由于这些原料的含量低、来源少、合成路线复杂、回收率低、代价高昂，不能满足生产的需要。薯蓣皂素的发现和应用，为留体药物的工业化生产提供了丰富而又廉价的原料，但是生产过程需要消耗大量的薯蓣皂素，使皂素价格不断上升，增加了生产成本，且生产过程严重污染环境。[0005] 近年来，薯蓣皂苷元的日益枯竭，各国都在积极寻找新的资源或新方法。植物甾醇作为新的资源为留体工业注入了新的生命力，并可以从一些废油的下脚料和各类农作物中获得。可以通过微生物选择性边链降解获得重要的甾体药物中间体AD和ADD。可以说目前几乎所有留体激素药物都是以AD或ADD作为起始原料进行生产的。微生物法具有成本低、对环境温和等优点，越来越受到人们的重视。世界先进国家目前进行留体药物制备，大多以动植物甾醇为起始原料进行微生物转化，得到AD和ADD后，再进一步制备。[0006] 3_留酬-ΔL脱氣酶3_留酬-ΔL脱氣酶3_ketosteroid-Δ1-dehydrogenase，KSDD或KSTD也称Cl，2位脱氢酶，它是留体母核降解的关键酶，属于黄素蛋白酶类，位于细胞膜上，能在留体母核Cl和C2之间引入双键，提高原有底物的抗炎活性及经济价值，实现AD向ADD转化，在留体药物开发上发挥着重要作用。对3-留酮-△I脱氢酶KSDD的深入研究对整个留体药物行业的发展意义深远。生产更高附加值的ADD最直接有效的方法就是以4AD为底物，通过微生物一步转化。[0007] 近年来，众多学者成功实现了来源于不同菌株的KSDD的外源表达。不同来源的KSDD在大肠杆菌系统中表达时，主要以无活性的包涵体形式存在，检测不到KSDD酶活或者酶活水平较低。本实验室前期实现了分枝杆菌的KSDD在大肠杆菌体系中的表达，并检测到酶活。[0008] 本发明通过质粒pET28a，实现了分枝杆菌KSDD在大肠杆菌BL21中的可溶性过量表达，酶活达1.75Umg，全细胞转化AD，12h后转化率达76.5%。分枝杆菌KSDD在大肠系统中表达及全细胞转化AD均为首次报道，且重组子表达的酶活及AD的转化率均较高。大肠杆菌作为安全稳定的工业生产菌株，培养条件简单，发酵周期短，成为微生物留醇发酵工业潜在生产菌株。发明内容[0009] 本发明的目的在于提供:通过基因工程手段来获得具有全细胞转化生产ADD能力的微生物的方法。对构建的重组菌株进行酶活力及发酵性能进行研究发现3-留酮-A1IA氢酶活力为出发菌的6倍左右，并且得到了较高的转化率。为微生物发酵生产ADD的工业化提供了有益的指导。[0010] 本发明的技术方案:是以基因工程为手段构建一株全细胞转化AD生成ADD重组大肠杆菌，以HPLC为方法检测发酵液中产物的生成，筛选阳性重组子，通过酶活力和发酵性能的检测来确定其目标酶的活力及底物转化率。本发明成功构建了一株以4-AD为底物全细胞转化为方法的高产ADD的大肠杆菌工程菌株，其3-留酮-ΔI脱氢酶活力和底物转化率较出发菌株有$父大提尚。[0011] 主要试剂:AD，ADD购自美国SIGMA公司[0012] 重组菌株构建方法:[0013] I3-甾酮-ΔI脱氢酶KSDD基因全序列的克隆[0014]根据GENBANK网站公布的Mycobacterium neoaurumstrainNffIBL01ksdD基因序列®Q228843.1，以及pET28a质粒上的酶切位点设计ksdD基因引物。以制备的新金色分枝杆菌染色体DNA为模板，以ksdDF、ksdDR为引物，通过PCR扩增出ksdD全序列。[0015] PCR反应体系:10XExTaqBuffer2.5yL，dNTP2yL，模板DNAlyL，上下游引物各0.5yL，ExTaq酶0.5yL，ddH20补齐至总体积25μΙ^ΡΟ?反应条件:94°C4min，94°C90s，59°C908，72。:1208，循环30次，72。:1011^11，15。:1011^11。[0016] 2重组表达载体pET28a_ksdD的构建[0017] 参照博大泰克公司胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，胶回收产物按一定比例与PMD18Tvector过夜连接，转化E.coliJM109感受态细胞，使用氨苄青霉素抗性平板筛选重组菌，重组质粒经BamHIHindΙΠ酶切释放出大小为2.7kb和1.7kb的基因条带，表明重组质粒构建成功，重组质粒命名为PMD18T-ksdDo[0018]提取保存于E.coliJMl09中的质粒pMD18T-ksdD和pET28a，质粒pMD18T_ksdD和pET28a经BamHIHindm双酶切，胶回收纯化，T4DNA连接酶过夜连接两片段，过夜后将连接物热击转化E.coliJM109感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子。提取转化子质粒，重组质粒经BamHIHindΙΠ双酶切后释放出大小为7.2kb和1.7kb的基因片段，证明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pET28a-ksdD。[0019] 3重组质粒pET28a-ksdD化学转化法转化模式菌株EscherichiacoliBL21中[0020] 将经验证构建成功的重组质粒pET28a-ksdD用化学转化法转化至模式菌株EscherichiacoliBL21中表达。[0021] ⑷重组菌株EscherichiacoliBL21阳性转化子的筛选；[0022] 挑取在具有卡那霉素抗生素压力平板上长出的菌落，摇瓶发酵，提取质粒进行酶切验证。[0023] 5重组EscherichiacoliBL21酶活测定，HPLC分析[0024] 酶活测定方法:采用PMSDCPIP的方法。具体方法如下:取培养24h的菌液50mL，4°C，8，000rmin离心5min收集菌体，用50mLpH7.5的I3BS缓冲液洗涤二次，重悬于3ml的该缓冲液中。冰浴中40%功率超声破碎，工作2s间歇5s，工作时间1min。10，000rmin离心30min获得上清液，取0.1mL上清液，加入含50mM的PBSPH7.5、40μΜ的2，6二氯酚靛酚、1.5mM的吩嗪硫酸甲酯、500yMAD溶于2%的甲醇总反应体系达3mL。30°C反应1min，检测600nm波长下吸光值变化情况。将每分钟内能引起0.01个吸光度单位变化的酶量定义为一个单位U。[0025] HPLC分析:AD与ADD在254nm紫外波长下均有特征吸收峰，所以采用HPLC法制定10μL，流速:1.0mlmino[0026] LB培养基:蛋白胨10gl，酵母膏5gL，NaCLl0gL個体培养基加入2%琼脂粉[0027] 转化条件:将重组大肠杆菌BL21以I%接种量接种于10mLLB培养基中，培养24h，离心回收菌体，洗涤两次，用适当的50mM的PBSPH7.5缓冲液复溶，按0.1%wv投4-AD和0.1%vvtween80，继续在30°C，160rpm培养。[0028] 本发明的有益效果:通过基因工程手段扩增本实验已有的具有3-甾酮-ΔI脱氢酶能力的新金色分枝杆菌的该酶基因，借助本实验室有的大肠表达体系，实现了3-甾酮-AI脱氢酶基因在模式菌株大肠杆菌BL21中的过量表达。将该菌株接种于以I%接种量接种于10mLLB培养基中，培养24h，离心回收菌体，洗涤两次，用适当的50mM的PBSPH7.5缓冲液复溶，加入0.1%wv4AD和0.1%vvtween80，继续在30°C，160rpm培养10h。最终底物摩尔转化率达到76.5%,比原始菌提高了约25倍。[0029] 将底物4-AD—步转化成具有更高附加价值的ADD，其是重要医药中间体;同时用微生物法生产ADD，其较之化学生产法具有反应条件温和、原料利用率高、产品纯度高及工艺简单、易于控制等优点，同时有利于环境保护，易于推广应用。附图说明[0030]无[0031] 具体实施方法[0032] 实施例1:重组EscherichiacoliBL21菌株的构建[0033]以实验室具有3-留酮-△ I脱氢酶活力的新金色分枝杆菌作为出发菌株，以其染色体为模板，利用PCR手段获得该酶的基因，连接克隆载体，实现基因的大量扩增。将大量扩增的KSDD基因片段，纯化后连接到pET28a载体上，验证成功后，转化模式菌株大肠杆菌BL21。在抗性平板上筛选阳性转化子，接种摇瓶发酵，用HPLC检测发酵液中产物ADD。检测到有产物ADD的为构建成功的具有转化AD为ADD能力的重组菌株。本发明最终得到具有转化AD产ADD的重组大肠杆菌BL21菌株。[0034] 实施例2:重组菌株的酶活力测定[0035] 菌株在LB培养基中过夜培养，8000rpm离心10111丨114!17.5的50111]\1PBS缓冲液清洗3次，悬浮在该缓冲液中，超声波破碎处理制备粗酶液。3ml反应混合物由10yL粗酶液、50mM的I3BSPH7.5、40μΜ的2，6二氯酚靛酚、1.5mM的吩嗪硫酸甲酯、500μΜAD溶于2%的甲醇所组成，检测600nm下的吸光值变化情况。酶活单位定义为:每分钟内能引起0.01个吸光度单位变化的酶量定义为一个单位U。测得重组菌株酶活为1.75Umgo[0036] 实施例3:重组菌株全细胞转化性能检测[0037] 将重组大肠杆菌BL21以1%接种量接种于100mlLB培养基中，培养24h，离心回收菌体，洗涤两次，用适当的50mM的I3BSpH7.5缓冲液复溶，加入0.I%wv4AD和0.1%vVTween80，继续在30°C，160rpm培养10h。经HPLC检测分析后，最终底物摩尔转化率达到76.5%，比出发菌提高了约25倍。

权利要求：1.一种重组表达载体pET28a-ksdD，其特征是:通过PCR技术获得来源于新金色分枝杆菌的KSDD基因与表达载体pET28a连接获得。2.一种重组大肠杆菌，其特征是:将权利要求1中构建的重组载体pET28a-ksdD，用化学转化法转化至菌株EscherichiacoliBL21获得。3.将权利要求2所述的重组大肠杆菌全细胞转化AD产ADD的方法，其特征是:将该菌株以10A接种量接种于10mLLB培养基中，培养24h，离心回收菌体，洗涤两次，用适当的50mM的PBSpH7.5缓冲液复溶，加入0.1%wv4AD和0.1%vvtween80，继续在30°C，160rpm培养IOh。

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