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申请/专利权人：三峡大学

摘要：本发明公开了一种可激活脑胶质瘤U251细胞中抑癌基因LRIG1表达的双链小激活RNA（dsLRIG‑712）及其应用。dsLRIG‑712由21个核苷酸的正义链和反义链构成，每条链的3’端均悬挂突出两个dTdT核苷酸，其余19个核苷酸相互配对。该saRNA分子能特异性激活LRIG1基因的表达，靶基因mRNA和蛋白表达水平均有升高，并抑制脑胶质瘤细胞的增殖和运动能力，达到抑制肿瘤生长的目的，可用于脑胶质瘤的治疗。

主权项：一种激活脑胶质瘤U251细胞中LRIG1表达的小分子RNA，其特征在于：小分子RNAdsLRIG1‑712为针对LRIG1基因启动子区相对转录起始点‑712附近设计的与该段启动子互补配对，长度为21个核苷酸碱基对的dsRNA分子，具体序列为：dsLRIG1‑712：Sense：UUU CCC ACC CAA GGU GUG A[dT][dT]；Antisense：UCA CAC CUU GGG UGG GAA A[dT][dT]。

全文数据：激活脑胶质瘤U251细胞中LRIG1表达的小分子RNA、筛选方法及其应用技术领域[0001]本发明提供一种可激活脑胶质瘤U251细胞中抑癌基因LRIGl表达的双链小激活RNAdsLRIG-712，并将dsLRIG-712用于脑胶质瘤的治疗。背景技术[0002]RNA激活RNAactivation,RNAa是由小分子双链RNA靶向作用于基因启动子区域，在转录水平诱导基因表达的现象。而具有激活功能的小dsRNA称之为小激活RNAsmallactivatingRNA,saRNA。早在1969年，Britten等发现，基因组非编码区转录出的RNA能够激活一大类基因的表达，并提出过激活RNAactivatorRNAs，RNAa的概念，但未获证实。直到2006年，saRNA才被Li等正式发现并命名，Li等在应用靶向E-钙黏素基因启动子区的siRNAdsEcad-302，dsEcad-215转染前列腺癌PC-3和DU-145时意外发现，目的基因没有发生预期的表达沉默，反而分别上调了14倍和3.8倍。之后，Janowski等将靶向孕酮受体proges-teronereceptor,PR基因的dsRNA转染乳腺癌T47D和MCF7细胞发现，PR的表达与对照组相比上调了18倍。Huang等通过对非洲绿猴、大猩猩以及小鼠、大鼠的研究发现，saRNAa在哺乳动物细胞中具有保守性，这项研究使建立动物模型并实施saRNA药物治疗的临床前实验成为了可能。[0003]脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发性肿瘤，具有侵袭性生长的特征，严重威胁人类健康。目前对脑胶质瘤尚无切实有效的治疗方法，使其成为神经外科领域研究重点。LRIGl是近年来新发现的肿瘤抑制基因，在正常人体各组织中均有表达，但在脑组织中的表达水平最高。研究发现LRIGl的表达水平与脑胶质瘤的肿瘤病理级别呈高度负相关，LRIGl的表达水平越低，脑胶质瘤的恶性程度越高。因此，通过激活LRIGl基因的表达可望达到抑制脑胶质瘤发生与发展的目的。发明内容[0004]本发明针对上述问题提供一种经筛选得到的治疗人中晚期神经胶质瘤的小分子RNA药物。具体如下：[0005]本发明所用的化学合成靶向LRIGl基因启动子的候选dsRNA分子和dsControl购自上海吉玛制药技术有限公司。人神经胶质瘤细胞U251细胞购自中国科学院细胞库，使用DMEM培养液购自吉诺生物医药技术有限公司、胎牛血清购自兰州百灵生物技术有限公司，转染试剂turbofect购自美国Thermo公司，Trizol购自美国Invitrogen公司，反转试剂盒购自美国Thermo公司，PCRMix购自天根生化科技有限公司，全蛋白提取试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司，BCA试剂盒购自武汉科瑞生物技术有限公司，Anti-LRIGl购自美国SantaCruz公司，辣根过氧化物酶HRP羊抗鼠、HRP羊抗鼠购自武汉科瑞生物技术有限公司，ECL化学发光试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。[0006]一种具有激活LRIGl基因表达的saRNA的筛选方法，包括如下步骤：[0007]ldsRNA的设计：dsLRIGl-712为针对LRIGl基因启动子区相对转录起始点-712附近设计的与该段启动子互补配对，长度为21个核苷酸碱基对的dsRNA分子，具体序列为：dsLRIGl-712：Sense：UUUCCCACCCAAGGUGUGA[dT][dT]；Antisense：UCACACCUUGGGUGGGAAA[dT][dT]。[0008]2细胞的培养与转染:U251细胞生长在含10%胎牛血清的DMEM培养液，37°C、5%CO2培养箱培养，用转染试剂将dsRNA转染入U251细胞；[0009]3总RNA的提取及半定量PCR分析：转染72h后收集细胞，用Trizol试剂提取总RNA，以IygRNA模版，依次在PCR管中加入ΙμΐOligodT，用DEPC水加至12μ1，将反应液置于70°C、5分钟后立即置于冰上1分钟，分别加入5Xbuffer4μ1，2〇υμ1核糖核酸酶抑制剂1μΐ，IOmMdNTPmix为2μ1和逆转录酶Ιμΐ，混合均匀，瞬时离心，将混合物置于PCR仪中完成后续反应:37£€511^11，421€601^11、70°：101^11，反转录为〇0嫩。以〇0嫩为模板，扩增目的基因LRIGl和GAPDH。引物序列：LRIGl上辦，下游5’-;GAPDH上游，下游5'—[0010]反应体系：[0011]PCR反应体系[0014]反应参数：94°C预变性5min、94°C变性30sec、55°C退火30sec、72°C延伸45sec、35个循环，72°C充分延伸lOmin。凝胶电泳检测PCR产物片段，LRIGl预期大小为892bp，GAPGH为230bp〇[0015]⑷Westernblot:dsRNA转染细胞72h后收集细胞用于蛋白表达的分析，用I3BS清洗细胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解后离心收集上清液，BCA试剂盒测定蛋白质溶液的OD值，调整样品的蛋白浓度，使各个样品的蛋白量均为20ug，actin为内参蛋白，对提取的蛋白进行SDS-PAGE胶电泳，蛋白转膜后，加入脱脂奶粉封闭液封闭、洗膜，按1:1000比例稀释LRIGl一抗（体积比，将5ulLRIGl抗体加入5mlTBS中），1:2000比例稀释actin—抗体积比，将2.5ulactin抗体加入5mlTBS中），将PVDF膜分别放入含各自一抗的溶液中，一抗4°C孵育过夜，洗膜。按照1:2000比例稀释HRP标记的二抗体积比），将PVDF膜加入稀释好的二抗，室温摇动孵育lh，洗膜;使用ECL化学发光试剂盒显影，检测dsLRIGl-712转染U251细胞后蛋白表达的改变。[0016]所述的步骤（2中，dsRNA终浓度为20nmolL，具体转染过程：加4uldsRNA至IOOul无血清DMEM培养液，加6ulturbofect转染试剂至至IOOul无血清DMEM培养液，两者混合，室温下放置15-20min，加dsRNA-turbofect复合物至6孔板中，6孔板细胞汇合度控制在50%，培养液终体积为4ml。[0017]所述的步骤（4中，所述的蛋白裂解液为：RIPA裂解液，成分为：50mMTriS-HClpH7.4,150mMNaCl,I%NP-40,0.1%SDS〇[0018]本发明得到的dsLRIGI-712与对照组相比，能显著激活LRIGI的表达，其中，LRIGlmRNA的相对表达量为对照组的2倍以上，LRIGl蛋白的表达量亦为对照组的2倍以上，表明dsLRIGl-712为功能性saRNA，具有特异性激活U251细胞中LRIGl基因的功能。U251细胞属于人神经胶质瘤细胞，通过上调该细胞中抑癌基因LRIGl的表达，可抑制U251细胞生长和迀移，可用于中晚期脑胶质瘤的治疗。附图说明[0019]图1为dsLRIGl-712转染U251细胞72h后mRNA表达水平。[0020]图2为dsLRIGl-712转染U251细胞72h后蛋白表达水平。具体实施方式[0021]实施例1[0022]dsRNA设计dsLRIGl-712为针对LRIGl基因启动子区相对转录起始点-712附近设计的与该段启动子互补配对，长度为21个核苷酸碱基对的dsRNA分子。对照组dsRNAdsControl与已知人基因组序列非同源，长度同样为21个核苷酸碱基对的dsRNA序列。[0023]利用Genebank数据库，找到LRIGl基因启动子区序列，针对启动子上游-712的序列作为设计dsRNA的模板，具体序列为：dsLRIGl-712:Sense:UUUCCCACCCAAGGUGUGA[dT][dT]!Antisense:UCACACCUUGGGUGGGAAA[dT][dT]。[0024]细胞培养与转染U251细胞生长在含10%胎牛血清的DMEM培养液，37°C、5%⑶2培养箱培养。实验分为3组:空白组、对照组转染dsControl和实验组转染候选dsRNA，每个实验组的dsRNA浓度为20nmolL。用转染试剂将dsLRIGl-712、dsControl分别转染入U251细胞。转染时细胞汇合度控制约为50%，将转染试剂turbofect、dsRNAs、无血清DMEM平衡至室温；用无血清DMEM培养液稀释适量dsRNAs，用同样的培养液稀释转染试剂turbofect;两者充分混勾后，室温静置20min以形成dsRNA-turbofect复合物，将dsRNA-turbofect复合物逐滴加入培养板中放置至细胞培养箱中继续培养。[0025]总RNA的提取及半定量PCR分析转染72h后收集细胞，用Trizol试剂提取总RNA，以IygRNA模版，依次在PCR管中加入ΙμΐOligodT，用DEPC水加至12μ1，将反应液置于70°C、5分钟后立即置于冰上1分钟，分别加入5Xbuffer4μ1，2〇υμ1核糖核酸酶抑制剂Ιμΐ，IOmMdNTPmix为2μ1和逆转录酶Ιμΐ，混合均匀，瞬时离心，将混合物置于PCR仪中完成后续反应：37°C5min，42°C60min、70°C10min，反转录为cDNA。以cDNA为模板，扩增目的基因LRIGl和GAPDH0弓I物序列：LRIGl上游5’-ATCATCACCCAGCCAGAAAd，下游5’-CTACCGTGGTCCCATCCTT—3’；GAPDH上游5’一AACGGATTTGGTCGTATTGGG—3、下游5'—CCTGGAAGATGGTGATGGGAT—3’，反应参数：94°C预变性5min、94°C变性30sec、55°C退火30sec、72°C延伸45sec、35个循环，72°C充分延伸10min。凝胶电泳检测PCR产物片段，LRIGl预期大小为892bp，GAPGH为230bp。[0026]Westernblot检测dsRNA转染细胞72h后收集细胞用于蛋白表达的分析，用PBS清洗细胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解后离心收集上清液，BCA试剂盒测定蛋白质溶液的OD值，调整样品的蛋白浓度，使各个样品的蛋白量均为20ug，actin为内参蛋白，对提取的蛋白进行SDS-PAGE胶电泳，蛋白转膜后，加入脱脂奶粉封闭液封闭、洗膜，按1:1000比例稀释LRIGl一抗（体积比，将5ulLRIGl抗体加入5mlTBS中），1:2000比例稀释actin—抗体积比，将2.5ulactin抗体加入5mlTBS中），将PVDF膜分别放入含各自一抗的溶液中，一抗4°C孵育过夜，洗膜。按照1:2000比例稀释HRP标记的二抗体积比），将PVDF膜加入稀释好的二抗，室温摇动孵育lh，洗膜;使用ECL化学发光试剂盒显影，检测dsLRIGl-712转染U251细胞后蛋白表达的改变。[0027]dsRNA对U251细胞靶基因LRIGImRNA水平的影响[0028]为明确dsLRIGl-712对LRIGl表达的激活作用，本研究通过半定量PCR法检测dsRNA转染后靶基因LRIGlmRNA的表达水平。根据靶基因表达水平筛选出功能性saRNAdsLRIGl-712以20nmolL的浓度转染U251细胞72h后，LRIGlmRNA的表达水平较对照组显著升高，见图1。[0029]dsRNA对U251细胞靶基因LRIGl蛋白质水平的影响为明确dsLRIGl-712对LRIGl蛋白表达的激活作用，本研究将dsLRIGl-712转染入U251细胞并通过Westernblot检测转染72h后各组细胞内LRIGl蛋白表达情况。结果表明，dsLRIGl-712组LRIGl蛋白表达水平较对照组显著升高，为对照组的2倍以上，见图2。

权利要求：1.一种激活脑胶质瘤U251细胞中LRIGl表达的小分子RNA，其特征在于：小分子RNAdsLRIGl-712为针对LRIGl基因启动子区相对转录起始点-712附近设计的与该段启动子互补配对，长度为21个核苷酸碱基对的dsRNA分子，具体序列为：dsLRIGl-712:Sense:UUUCCCACCCAAGGUGUGA[dT][dT]!Antisense:UCACACCUUGGGUGGGAAA[dT][dT]〇2.激活脑胶质瘤U251细胞中LRIGl表达的小分子RNA的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：1细胞的培养与转染:U251细胞生长在含质量分数为10%胎牛血清的DMEM培养液，37°C、5%CO2培养箱培养，用转染试剂将dsRNA转染入U251细胞；2总RNA的提取及半定量PCR分析:转染72h后收集细胞，用Trizol试剂提取总RNA，以RNA模版，在PCR管中加入OligodT，用DEPC水加至刻度线，将反应液置于65-80°C水浴中、5分钟后立即置于冰上1分钟，分别加入5Xbuffer，核糖核酸酶抑制剂，dNTPmix和逆转录酶，混合均匀，瞬时离心，将混合物置于PCR仪中完成后续反应:37°C5min，42°C60min、70°ClOmin，反转录为cDNA;3Westernblot:dsRNA转染细胞72h后收集细胞用于蛋白表达的分析，用PBS清洗细胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解后离心收集上清液，BCA试剂盒测定蛋白质溶液的OD值，调整样品的蛋白浓度，actin为内参蛋白，对提取的蛋白进行SDS-PAGE胶电泳，蛋白转膜后，加入脱脂奶粉封闭液封闭、洗膜，按1:1000比例稀释LRIGl—抗，1:2000比例稀释actin—抗，将PVDF膜分别放入含各自一抗的溶液中，一抗4°C孵育过夜，洗膜，按照1:2000比例稀释HRP标记的二抗，将PVDF膜加入稀释好的二抗，室温摇动孵育lh，洗膜;使用ECL化学发光试剂盒显影，检测dsLRIGl-712转染U251细胞后蛋白表达的改变，即可完成筛选具有激活LRIGl基因表达的saRNA。3.权利要求2所述的激活脑胶质瘤U251细胞中LRIGl表达的小分子RNA的筛选方法，其特征在于，以cDNA为模板，扩增目的基因LRIGl和GAPDH，引物序列：LRIGl上游5’-ATCATCACCCAGCCAGAAAC-3’，下游5’-CTACCGTGGTCCCATCCTT-3’；GAPDH上游5’-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3'，下游5'-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3’。4.权利要求2所述的激活脑胶质瘤U251细胞中LRIGl表达的小分子RNA的筛选方法，其特征在于，PCR反应体系如下：反应参数:94°C预变性5min、94°C变性30sec、55°C退火30sec、72°C延伸45sec、35个循环，72°C充分延伸lOmin，凝胶电泳检测PCR产物片段，LRIGl预期大小为892bp，GAPGH为230bp〇5.权利要求1-4任一项所述筛选得到的具有激活LRIGl基因表达的saRNA在人脑胶质瘤药物治疗上的应用。

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