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申请/专利权人：复旦大学

摘要：本发明属于药学技术领域，涉及中草药苦豆子中分离得到的化合物槐黄酮GSophoraflavanone G在制备抗耐药菌药物中的应用，本发明中，经对于含有NorA耐药外泵基因的耐氟喹诺酮类耐药金黄色葡萄球菌株SA1199B实验显示，槐黄酮G与抗生素诺氟沙星配伍时能使诺氟沙星的最低抑菌浓度值降低16倍；本发明中槐黄酮G能使诺氟沙星的用药量减少到该种抗生素单独抑菌用量的116，经动物体内抗菌实验验证，槐黄酮G与抗生素诺氟沙星联用具有协同抗耐药金葡菌感染作用。本发明的化合物槐黄酮G可用于制备抗生素诺氟沙星增效药物。

主权项：1.式I的化合物槐黄酮G在制备抗耐药菌药物中的应用，其中，化合物槐黄酮G通过下述方法分离制备，乙醇加热提取中草药苦豆子根，浓缩得到浸膏，用水混悬，乙酸乙酯萃，得萃取物；萃取物经过反复硅胶柱色谱和凝胶柱色谱，分离纯化，得到式I所示的二氢黄酮类化合物槐黄酮G，其中，硅胶柱色谱中使用硅胶为200‑300目和300‑400目，溶剂为氯仿‑丙酮95∶5～9∶1；凝胶柱色谱中使用凝胶为Sephadex LH‑2葡聚糖凝胶，溶剂为氯仿‑甲醇1∶1；所述的分离纯化得到的槐黄酮G纯度大于98.0％。

全文数据：槐黄酮G在制备抗耐药菌药物中的应用技术领域本发明属药学技术领域，涉及化合物槐黄酮G的药物新用途，具体涉及化合物槐黄酮GSophoraflavanoneG在制备抗耐药菌药物中的应用，尤其是槐黄酮G与抗生素联合在制备抗耐氟喹诺酮类耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的应用。技术背景据报道，耐药菌引起的感染日益严重，抗生素耐药性被世界卫生组织认为是治疗感染性疾病的最大威胁，其中，耐甲氧西林金黄葡萄球菌Methicillin-ResistantStaphylococcusaureus，MRSA是医院内最常见的感染病菌之一。现有技术公开了诺氟沙星属氟喹诺酮类抗生素，二十世纪八十年代中后期开始用于临床。不容忽视的是，包括诺氟沙星在内的氟喹诺酮类抗生素药物存在着严重的毒副作用和药物不良反应，但因为该类抗生素对革兰氏阳性菌，尤其是金黄色葡萄球菌，具有较强的抑制作用而产生显著的尿道、呼吸道等抗感染效果，至今仍用于临床治疗。研究显示，药物的毒性与其使用剂量有直接关系，因此，如果能够利用现有抗生素在产生同样的抗菌效果前提下而降低其使用剂量，将可以在达到耐氟喹诺酮金葡菌临床治疗效果的情况下，降低诺氟沙星的毒副作用，从而实现更高的用药安全性；有研究报道，金葡菌对氟喹诺酮类抗生素也已经产生了耐药性，但诺氟沙星作为经典抗生素药物，其生产成本低，如果在抗菌药物制造中，通过形成药物组合物对诺氟沙星进行再利用，则有利于增强其抗感染治疗效果，降低其毒副作用和患者治疗成本。天然产物作为新的化学实体的重要来源，为寻找和发现抗菌增敏剂提供了宝贵资源。中草药苦豆子是豆科槐属植物，根和全草皆可入药，主要分布于中国北方的荒漠、半荒漠地区。传统功效具有清热燥湿、止痛、杀虫的作用，现代药理学研究表明苦豆子具有抗病毒、抗炎和抗肿瘤等药理作用。基于现有技术的现状，本申请的发明人拟选择具有NorA外泵基因的MRSA细菌株作为外泵抑制剂的筛选靶标作为重要途径，寻找具有外泵抑制作用的抗耐药金葡菌抗生素增敏剂，具体涉及提供槐黄酮G在制备抗耐药菌药物中新的药用用途。与本发明相关的现有技术有，[1]McArthurAG，WaglechnerN，NizamF，YanA，AzadMAetal.TheComprehensiveAntibioticResistanceDatabase.AntimicrobAgentsandChemother.2013，577：3348-3357.[2]胡付品，朱德妹，汪复，蒋晓飞，孙自镛等.2013年中国CHINET细菌耐药性监测.中国感染与化疗杂志.2014，145：365-374.[3]LiTM，SongY，ZhuYJ，DuX，LiM.CurrentstatusofStaphylococcusaureusinfectioninacentralteachinghospitalinShanghai，China.BMCMicrobiology.2013，131：153.[4]HolmesB，BrogdenRN，RichardsDM.Norfloxacin.Drugs.1985，306：482-513.[5]陈刚，张云端.诺氟沙星的不良反应.青岛医药卫生.1997，292：49-50.[6]FeriaG，RosenblumM，StennerJ，CastilloA，OsornioJS.Efficacyandsafetyofnorfloxacinversuscarbenicillinindanylsodiuminthetreatmentofbacterialprostatitis.CurrTherResCline.1993，532：154-158.[7]FabregaA，MadurgaS，GiraltE，VilaJ.Mechanismofactionofandresistancetoquinolones.MicrobBiotechnol.2009，21：40-61.发明内容本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷与不足，提供化合物槐黄酮GSophoraflavanoneG在制备抗耐药菌药物中的应用，尤其是槐黄酮G与抗生素联合在制备抗耐氟喹诺酮类耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的应用。本发明中，选择具有NorA外泵基因的MRSA细菌株作为外泵抑制剂的筛选靶标作为重要途径，寻找具有外泵抑制作用的抗耐药金葡菌抗生素增敏剂，通过对中草药苦豆子根乙醇提取物进行分离纯化和协同抗菌活性测试，得到一种能够增强抗生素抗菌作用的物质槐黄酮GSophoraflavanoneG，采用槐黄酮G与诺氟沙星配伍成组合药物，能极大降低诺氟沙星的最低抑菌浓度，对诺氟沙星产生抗耐药金葡菌的增效作用，提供了槐黄酮G在制备抗耐药菌药物中新的药用用途；尤其是槐黄酮G与抗生素联合在制备抗耐氟喹诺酮类耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的应用。本发明中，通过对中草药苦豆子根乙醇提取物进行分离纯化获得化合物槐黄酮G，其通过下述方法：乙醇加热提取中草药苦豆子根5.5kg，浓缩得到浸膏，用水混悬，乙酸乙酯萃，得到萃取物196g；萃取物经过反复硅胶柱色谱氯仿-丙酮系统和凝胶柱色谱氯仿-甲醇系统，分离纯化，得到如式I化学结构式所示的二氢黄酮类化合物槐黄酮G6.5g，本发明中，硅胶柱色谱分离化合物使用硅胶为200-300目和300-400目，溶剂为氯仿-丙酮95∶5～9∶1；凝胶柱色谱分离化合物使用凝胶为SephadexLH-2葡聚糖凝胶，溶剂为氯仿-甲醇1∶1。本发明进行了化合物槐黄酮G抗菌活性测试，天然化合物槐黄酮G与抗生素诺氟沙星不同浓度下进行对耐氟喹诺酮金葡菌SA1199B菌株体外单独抑菌实验，及两者形成不同配比例的组合物进行抑菌试验，结果显示，所述化合物槐黄酮G对诺氟沙星以协同作用方式产生抑菌增效作用，协同增效作用明显；固定化合物槐黄酮G的浓度与不同浓度诺氟沙星对SA1199B菌株进行体内抑菌实验，结果显示化合物槐黄酮G与诺氟沙星体内协同抑菌增效作用明显。本发明中，所述的协同作用方法试验化合物槐黄酮G对抗生素的增效作用中，取适量诺氟沙星溶于DMSO配成抗生素母液，取适量诺氟沙星母液溶于肉汤中配成诺氟沙星原液；取化合物槐黄酮G样品适量溶于DMSO配成母液，取一定量的化合物槐黄酮G母液加至盛有肉汤的试管1中，混匀，配成浓度为24mgL溶液，然后等倍稀释，直至试管7；菌悬液配置成5×105CFUmL，往96孔板每孔加入适量肉汤，首列诺氟沙星浓度为64mgL，等倍稀释至第10列。向第8行的每孔加入等量肉汤，其余各行加等量的相对应编号试管里的溶液，往除第十二列外的每孔中加入等量菌悬液，将此96孔板于37℃的培养箱中培养24小时，加入MTT，观察；记录每行细菌刚好不生长的那个孔所对应的诺氟沙星的浓度，其中96孔板H行显示的是诺氟沙星单用时的MIC，其他行显示的是与化合物样品联用时诺氟沙星的MIC值；结果显示，所述化合物槐黄酮G对诺氟沙星以协同作用方式产生抑菌增效作用，协同增效作用明显；本发明中，进行了槐黄酮G与诺氟沙星体内协同抗小鼠耐药菌感染活性实验，建立耐药金葡菌菌株SA1199B感染的小鼠脓毒症模型，测试槐黄酮G单独作用180mgkg、诺氟沙星单独作用180mgkg以及槐黄酮G100mgkg与三种不同剂量诺氟沙星60mgkg，90mgkg和120mgkg联合使用的小鼠7天生存率曲线；其中，体外协同抗耐药菌活性实验的耐药金葡菌浓度为5×105cfumL；小鼠生存率曲线实验的耐药金葡菌浓度为106cfumL；体外协同抗菌活性实验的槐黄酮G浓度为0.125-8mgL；诺氟沙星的浓度为1-64mgL；体外抗耐药菌实验结果显示部分抑菌浓度指数FIC小于0.5，表明槐黄酮G具有协同提高诺氟沙星的抗耐药金葡菌感染作用；本发明中，小鼠生存率曲线实验的槐黄酮G的单独给药剂量为180mgkg，联合给药剂量为100mgkg，给药方式均为灌胃给药；小鼠生存率曲线实验的诺氟沙星的单独给药剂量为180mgkg，联合给药剂量分别为60mgkg，90mgkg和120mgkg，给药方式均为灌胃给药；体内抗感染实验证明，槐黄酮G能协同提高诺氟沙星的抗耐药金葡菌感染作用，提高耐药菌感染小鼠生存率。本发明经实验结果显示，所述化合物槐黄酮G对诺氟沙星以协同作用方式产生抑菌增效作用，协同增效作用明显；化合物槐黄酮G的浓度与不同浓度诺氟沙星对SA1199B菌株进行体内抑菌实验，结果显示化合物槐黄酮G与诺氟沙星体内协同抑菌增效作用明显，槐黄酮G与抗生素诺氟沙星配伍时能使诺氟沙星的最低抑菌浓度值降低16倍；槐黄酮G能使诺氟沙星的用药量减少到该种抗生素单独抑菌用量的116；本发明的化合物槐黄酮G可用于制备抗生素诺氟沙星增效药物，尤其是槐黄酮G与抗生素联合制备抗耐氟喹诺酮类耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物。附图说明图1.槐黄酮G与诺氟沙星联用抗菌等效曲线。图2.槐黄酮G协同诺氟沙星提高耐药菌感染小鼠生存率曲线。具体实施方式现结合实施例，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。实施例中所用苦豆子Sophoraalopecuroides根，采集于新疆石河子。下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下面实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。实施例1.槐黄酮G分离纯化苦豆子根5.5kg以95％乙醇加热提取45℃，真空减压浓缩得到浸膏685.0g。浸膏用水混悬，以乙酸乙酯萃取并浓缩，得到乙酸乙酯萃取物196.0g；乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱色谱分离200-300目，使用二氯甲烷-丙酮98∶2，95∶5，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4进行梯度洗脱，得到Fr.1-Fr.13。Fr.810.2g经过硅胶柱色谱300-400目，氯仿-丙酮95∶5-9∶1得到Fr.8-1～Fr.8-5。Fr.8-3经反复凝胶柱色谱sephadexLH-20，氯仿-甲醇1∶1和硅胶柱色谱300-400目，氯仿-丙酮9∶1得到槐黄酮G6.5g，经过HPLC分析甲醇∶水＝7∶3纯度大于98.0％。实施例2.槐黄酮G体外协同抗耐药菌活性化合物槐黄酮G和诺氟沙星按上述协同作用试验方法进行化合物协同抗生素增效作用试验。实验菌SA1199B为过度表达NorA多药耐药外泵蛋白的金黄色葡萄球菌，对于耐药菌株SA1199B，诺氟沙星的MIC值为32mgL，化合物槐黄酮G对此菌株的MIC值为4mgL，但与诺氟沙星配伍时，能使诺氟沙星对菌株SA1199B的MIC值降至2mgL，比单用诺氟沙星时MIC降低了16倍图1。结果显示，FICI≤0.5，具有协同作用如表1所示。表1.化合物及诺氟沙星对耐药菌种SA1199B的最低抑菌浓度MIC和抑菌浓度指数FICI实施例3.槐黄酮G体内协同提高耐药菌感染小鼠的生存率槐黄酮G：分别取54mg和90mg槐黄酮G，分别溶解于0.15mL和0.45mLDMSO中，随后分别加入0.5％的羧甲基纤维素纳CMC-Na水溶液至3mL和9mL，制备成混悬液；抗生素：分别取18mg，27mg，36mg和54mg诺氟沙星，分别溶解于0.15mLDMSO中，随后分别加入0.5％的羧甲基纤维素纳CMC-Na水溶液至3mL，制备成混悬液；取耐药金葡菌菌株SA1199B液，划线接种于MH平板，培养24小时接种于MH液体培养基中，37℃摇床培养12小时，离心后弃上清，再以PBS缓冲液洗，用PBS缓冲液混合均匀；将小鼠随机分为6组，每组10只。其中给药组5组，模型组1组。所有小鼠提供充足的饲料和饮水。各组小鼠分别经尾静脉注射0.2mL20g菌液106CFUmL。细菌感染1小时后，模型组小鼠第I组给予等量基质溶液，给药组小鼠第II、III、IV、V、VI组分别给予槐黄酮G180mgkg、诺氟沙星180mgkg、100mgkg槐黄酮G加60mgkg诺氟沙星，100mgkg槐黄酮G加90mgkg诺氟沙星以及100mgkg槐黄酮G加120mgkg诺氟沙星。给药后观察小鼠的一般体征，每隔12h观察一次小鼠的死亡情况；给药12h内，模型组小鼠全部死亡，化合物单独给药组小鼠在给药12h内死亡6只，给药24h内全部死亡，抗生素单独给药组小鼠在12h死亡2只，24h内死亡5只，48h内死亡6只；如图2所示，低浓度协同组抗生素60mgkg小鼠在给药24h内死亡2只，48h内死亡5只，3d内死亡6只，最后7天生存率为40％，而中浓度组抗生素90mgkg小鼠24小时内死亡3只，3d内死亡4只，4d内死亡5只，最后的7天生存率是50％。高浓度协同组抗生素120mgkg小鼠在24小时无死亡，48小时内死亡3只，最后的7天生存率为70％，结果表明，槐黄酮G能够协同提高诺氟沙星体内抗耐药金葡菌感染作用，显著提高耐药菌感染小鼠的生存率。

权利要求：1.式I的化合物槐黄酮G在制备抗耐药菌药物中的应用，其中，化合物槐黄酮G通过下述方法分离制备，乙醇加热提取中草药苦豆子根，浓缩得到浸膏，用水混悬，乙酸乙酯萃，得萃取物；萃取物经过反复硅胶柱色谱和凝胶柱色谱，分离纯化，得到式I所示的二氢黄酮类化合物槐黄酮G，其中，硅胶柱色谱中使用硅胶为200-300目和300-400目，溶剂为氯仿-丙酮95∶5～9∶1；凝胶柱色谱中使用凝胶为SephadexLH-2葡聚糖凝胶，溶剂为氯仿-甲醇1∶1；所述的分离纯化得到的槐黄酮G纯度大于98.0％。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗耐药细菌药物为抗菌增效剂。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的化合物槐黄酮G与诺氟沙星或其它氟喹诺酮类抗生素组成具有抗耐药金黄色葡萄球菌的药物组合物。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，槐黄酮G与抗生素体外协同抗耐药金葡菌活性；槐黄酮G与抗生素体内协同提高耐药金葡菌感染小鼠的生存率。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，槐黄酮G与诺氟沙星联用协同抑制耐药金葡菌菌株SA1199B。6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的耐药金葡菌为耐甲氧西林同时具有对氟喹诺酮类抗生素药物的耐药性。7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述槐黄酮G与诺氟沙星联用提高抗生素对耐药金葡菌SA1199B的抑制效果，其中，诺氟沙星对耐药金葡菌株SA1199B的最低抑菌浓度为单独使用时的十六分之一。

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