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申请/专利权人：大连医科大学

摘要：本发明公开了poFUT1在制备胎盘血管生成药物和RhoA信号通路激活剂药物中的应用。本发明将poFUT1作为RhoA信号通路激活剂，证明了其对滋养层细胞的增殖、迁移能力和胎盘血管生成能力的影响以及其作用机制，这将有助于深入理解胚胎植入机理的研究，并为临床上以糖为靶点的流产等妊娠相关疾病的诊断和治疗提供新的理论依据。

主权项：1.poFUT1在制备血管生成药物中的应用。

全文数据：poFUT1在制备胎盘血管生成药物和RhoA信号通路激活剂药物中的应用技术领域本发明属于生物医药领域。具体地说，本发明涉及poFUT1在制备胎盘血管生成药物和RhoA信号通路激活剂药物中的应用。背景技术胚胎着床是一个复杂的生物学过程，需要成熟的胚胎和接受态的子宫内膜同时建立。在胚胎植入的过程中，胚泡表面的滋养层介导胚胎和子宫内膜之间的识别，进而促进胚胎的植入、胎盘发育以及维持成功的妊娠。滋养细胞具有高侵袭性和增殖特性，在胚胎植入过程中发挥重要作用。在正常妊娠过程中，滋养层细胞能够降解细胞外基质、侵入母体内膜及血管，建立母胎之间的连接。胎盘血管网络的形成及发育包括通过形成新的血管和扩大原有血管以增加血流，保证妊娠期间有足够的血液灌注，是妊娠期间母体和胎儿之间的呼吸气体、营养物质和废物的交换的基础[1]。胎盘血管发育异常会导致各种妊娠并发症，如胎儿生长受限、子痫前期、胚亡或流产[2-4]。胎盘血管网络的建立包括血管发生、血管形成和滋养层细胞介导的螺旋动脉的重塑。血管形成是指孕早期通过分支或拉长原先存在的血管以建立新的血管网络的过程。胎盘血管的生成与重塑主要是由血管内皮细胞和滋养层细胞相互作用，共同完成的。胚泡植入后，胎盘表面的细胞滋养层细胞Cytotrophoblast,CTBs，可以分化为绒毛外滋养细胞Extravillouscytotrophoblasts,EVTs负责建立植入部位，或分化为合体滋养细胞Syncytiotrophoblast,STB覆盖在胎盘表面，调节母胎界面分子交换[5]。本研究，我们主要探讨EVTs在螺旋动脉重塑过程中发挥的作用。在孕早期，绒毛外滋养层细胞附着于子宫内膜上皮以后可以形成两个不同的细胞群，间质滋养细胞iCTB和血管内滋养细胞eCTB，二者均参与母体螺旋小动脉的重塑，促进胎盘血管形成[6,7]。蛋白质糖基化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式，在许多生理和病理过程中均有着重要的作用，包括炎症、胚胎植入、肿瘤转移。蛋白质糖基化是一种酶促反应，可在糖链和蛋白质之间产生糖苷键。蛋白质O-岩藻糖基化主要由两种糖基转移酶催化合成，蛋白质O-岩藻糖基转移酶1poFUT1和蛋白质O-岩藻糖基转移酶2poFUT2。poFUT1定位于内质网ER，可催化类表皮生长因子EGF结构域的底物，将L-岩藻糖直接以糖苷键的形式连接到蛋白质的丝氨酸苏氨酸残基上。已有报道表明，Notch受体EGF重复上的O-岩藻糖残基对其功能必不可少[8]，裸鼠胚胎的表型证明poFUT1与Notch信号传导途径有关[9,10]。O-岩藻糖基化的异常可能影响胚胎的正常发育，导致胚胎致死[11]。实验室前期研究表明，poFUT1促进滋养层细胞在母胎界面的迁移和侵袭[12]，也促进滋养细胞增殖[13]。然而，poFUT1在胚胎血管生成中的作用及其具体机制尚不明确。1.Blois,S.M.,etal.,Earlyexpressionofpregnancy-specificglycoprotein22PSG22bytrophoblastcellsmodulatesangiogenesisinmice.BiolReprod,2012.866:p.191.2.Francis,V.A.,etal.,Kisspeptinregulationofgenesinvolvedincellinvasionandangiogenesisinfirsttrimesterhumantrophoblastcells.PLoSOne,2014.96:p.e99680.3.Wallace,A.E.,R.Fraser,andJ.E.Cartwright,Extravilloustrophoblastanddecidualnaturalkillercells:aremodellingpartnership.HumReprodUpdate,2012.184:p.458-71.4.Anton,L.,etal.,PlacentalexpressionofmiR-517abandmiR-517ccontributestotrophoblastdysfunctionandpreeclampsia.PLoSOne,2015.103:p.e0122707.5.Xie,Y.,etal.,InductionofforkheadboxM1FoxM1byEGFthroughERKsignalingpathwaypromotestrophoblastcellinvasion.CellTissueRes,2015.3622:p.421-30.6.Lala,P.K.andP.Nandi,Mechanismsoftrophoblastmigration,endometrialangiogenesisinpreeclampsia:Theroleofdecorin.CellAdhMigr,2016.101-2:p.111-25.7.Doridot,L.,etal.,Trophoblasts,invasion,andmicroRNA.FrontGenet,2013.4:p.248.8.Du,J.,etal.,O-fucosylationofthrombospondintype1repeatsrestrictsepithelialtomesenchymaltransitionEMTandmaintainsepiblastpluripotencyduringmousegastrulation.DevBiol,2010.3461:p.25-38.9.Raghu,H.,etal.,SuppressionofuPAanduPARattenuatesangiogeninmediatedangiogenesisinendothelialandglioblastomacelllines.PLoSOne,2010.58:p.e12458.10.Stepanova,V.,etal.,Urokinase-typePlasminogenActivatoruPAPromotesAngiogenesisbyAttenuatingProline-richHomeodomainProteinPRHTranscriptionFactorActivityandDe-repressingVascularEndothelialGrowthFactorVEGFReceptorExpression.JBiolChem,2016.29129:p.15029-45.11.Al-Shareffi,E.,etal.,6-alkynylfucoseisabioorthogonalanalogforO-fucosylationofepidermalgrowthfactor-likerepeatsandthrombospondintype-1repeatsbyproteinO-fucosyltransferases1and2.Glycobiology,2013.232:p.188-98.12.Liu,S.,etal.,LIFupregulatespoFUT1expressionandpromotestrophoblastcellmigrationandinvasionatthefetal-maternalinterface.CellDeathDis,2014.5:p.e1396.13.Liu,C.,etal.,ProteinO-fucosyltransferase1promotestrophoblastcellproliferationthroughactivationofMAPKandPI3KAktsignalingpathways.BiomedPharmacother,2017.88:p.95-101.发明内容本发明提供了一种RhoA信号通路激活剂poFUT1，及其在制备血管生成药物中的应用。证明了其对滋养层细胞的增殖、迁移能力和血管生成能力的影响以及其作用机制，这将有助于深入理解胚胎植入机理的研究，并为临床上以糖为靶点的流产等妊娠相关疾病的诊断和治疗提供新的理论依据。本发明提供poFUT1在制备血管生成药物中的应用。所述血管优选为胎盘血管。进一步地在上述发明内容中，本发明提供了poFUT1在制备RhoA信号通路激活剂中的应用。所述激活剂包括含有poFUT1基因的质粒或含有poFUT1基因的蛋白。本发明通过Real-timePCR、Westernblot、Transwell和基质胶成管实验证明了poFUT1可以促进滋养层细胞的血管的形成。本发明通过O-Fucose试剂盒检测滋养细胞总O-岩藻糖的表达，从而证明转染poFUT1siRNA，滋养细胞中总O-岩藻糖表达降低，而在此基础上转染poFUT1cDNA可以回调O-岩藻糖的合成。本发明通过细胞周期蛋白的Westernblot、Transwell、基质胶成管实验和RhoA信号通路的Westernblot实验证明了poFUT1通过增加滋养层细胞O-岩藻糖基化的合成促进其增殖、迁移和血管形成。本发明通过对鸡胚绒毛尿囊膜实验证明了与PBS组相比，加绒毛组织处理组尿囊膜上毛细血管分布和充血状态显著增加。而绒毛组织经poFUT1siRNA处理后，与未经处理绒毛组相比，血管分支减少，充血状态降低。发明有益效果1.poFUT1可以促进滋养层细胞的增殖、迁移，同时可以促进滋养细胞的血管生成。2.poFUT1可以促进滋养层细胞O-岩藻糖的生物合成，进而影响血管生成。3.poFUT1通过激活RhoA信号通路，进一步提高血管生成能力。附图说明图1为poFUT1促进滋养层细胞的血管形成图1A为Real-timePCR检测poFUT1cDNA和poFUT1siRNA的转染效率结果；图1B为Westernblot检测poFUT1cDNA和poFUT1siRNA的转染效率结果；图1C为Transwell实验结果；图1D为Westernblot检测血管生成相关蛋白表达结果；图1E为基质胶成管实验结果；图2为O-Fucose试剂盒检测滋养细胞表面总O-岩藻糖的表达；图3为poFUT1通过增加滋养层细胞O-岩藻糖基化的合成促进其增殖、迁移和血管形成图3A为周期蛋白的Westernblot结果；图3B为Transwell实验结果；图3C为基质胶成管实验结果；图3D为RhoA信号通路的Westernblot结果；；图4为鸡胚绒毛尿囊膜体内验证。具体实施方式下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。本发明实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均由商业途径获得，或者由常规方法制备。使用GraphPadPrism6.0对数据进行整理和分析，每个数据代表多个独立实验的方法和结果，结果以均数±标准差或对照组的％来呈现，t检验计算显著性。以*p2O补齐至20μL冰上操作，离心10s。按下列条件反应：94℃预变性30s，94℃变性5s，60℃退火30s，扩增40个循环。上述PCR扩增引物序列如下表所示：实验结果如图1A所示，结果表明转染poFUT1cDNA组，poFUT1的表达显著增加，而转染poFUT1siRNA组，poFUT1的表达降低。2.Westernblot检测poFUT1cDNA、poFUT1siRNA的转染效率实验1总蛋白提取：取出处理后的细胞，弃上清，将细胞用PBS洗2次，然后根据细胞量加入适当的细胞裂解液，冰上孵育10分钟。用蛋白刮刮取细胞，置于1.5mLEP管中，封口膜封口，置于沸水中煮15分钟。细胞裂解物通过在9000g离心15分钟澄清，收集上清液。使用牛血清白蛋白BSA作为标准，用G-250测定蛋白质浓度，-20℃保存备用。2BCA蛋白定量①取7个EP管标号1～7，管2～6分别加入30μL去离子水，管6加入2μgμL的BSA30μL，充分混匀，从管6中取30μL加入到管5，管5混匀后取30μL到管4，依次稀释到管2，管1直接加入30μL去离子水，管7加入30μLBSA。②将待测样品稀释适当倍数稀释5倍，5μL样品+20μL去离子水。③使用BCA蛋白含量检测试剂盒，工作液以A液：B液＝50：1配置，准备新的EP管，每个EP管加200μL工作液。④标准品从①管1～7顺序依次取20μL加于③200μL工作液中，稀释好的样品取20μL加于200μL工作液中。⑤将④每管取200μL加于96孔板中，将微孔板密封，37℃孵育30min，用酶标仪上测定598nm的吸光值。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线，将样品的OD值代入计算样品的浓度。3SDS-PAGE电泳①装板：清洗玻璃板，对齐夹紧，垂直卡在胶架上，加入去离子水，静置10min，检查玻璃板是否漏水。倒掉水，擦干玻璃板待用。②灌胶：按下表配置分离胶和浓缩胶，充分摇匀。先将分离胶沿玻璃板的内面缓缓加入，小心不要产生气泡，留出2cm左右的空间。加入无水乙醇封胶，室温放置30～40min。弃去乙醇，擦去残留的水分，缓慢加入浓缩胶，迅速插入梳子，室温放置30～40min，待胶体凝固，小心拔出梳子，放于电泳液电泳缓冲液：分别称量甘氨酸14.11g，Tris3g，SDS1g，加入去离子水充分搅拌溶解，定容至1L中备用。分离胶和浓缩胶配方：12％分离胶mL6％浓缩胶mL蒸馏水3.32.2530％聚丙烯酰胺溶液41浓缩胶缓冲液-1.25分离胶缓冲液2.5-10％SDS溶液0.10.0510％AP溶液0.10.05TEMED0.0060.004③电泳：将胶固定于电泳槽内，加入电泳液，用针管冲洗孔道。根据蛋白浓度，用微量加样器加样，每个孔道加40μg的蛋白样品。盖好上盖，连接电泳仪开始电泳。先将电压控制在80～100V，30min后将电压调至130V，电泳过程中需保持电压稳定。为保证电泳过程中温度不至于过高，需冰浴。根据目的条带分子量要求，适时终止电泳。④转膜：小心将板拆离，根据分子量要求切胶。根据所切胶大小裁滤纸和醋酸纤维素膜NC。按电转移的方法将蛋白转移至NC膜上。丽春红染色，观察转膜情况。⑤封闭：将NC膜放于5％的脱脂奶粉，室温放置2h。⑥抗体孵育：配置一抗兔抗人poFUT11：1000；兔抗人GAPDH1：2000，4℃过夜孵育，次日，TBST洗膜，15min洗3次。然后用HRP标记的二抗羊抗兔IgG1：3000；羊抗鼠IgG1：2000室温孵育1h。TBST洗膜，15min洗3次。⑦HRP-ECL显色法：发光液A液、B液以1：1的混匀，避光放置。将NC膜用滤纸擦干，添加发光液，置于Bio-RadChemiDocMPImagingSystem进行显色，用ImagingLab分析条带。结果：实验结果如图1B所示，结论与上述RT-PCR检测poFUT1cDNA、poFUT1siRNA的转染效率实验所得结论一致。3.Transwell实验1制备细胞悬液：分别将转染poFUT1cDNA和poFUT1siRNA的细胞用0.25％的胰酶消化处理，低速离心3～5min，用PBS洗1～2遍，用无血清培养基重悬细胞。用计数板测悬液细胞密度，计数不少于3次。2接种细胞：将5×105个细胞加入到Transwell上室中，24孔板下室一般加入600μl含FBS的培养基，过程中尽量避免气泡的产生，置于培养箱中培养12～24h。3结果统计：取出transwell小室，弃去小室中的培养基，PBS洗两遍，小室中加1mL甲醇固定10min，弃去甲醇，0.1％结晶紫染色20min，PBS洗2遍，用棉签小心擦去上室中未迁移过去的细胞，显微镜观察计数。结果如图1C所示，与对照组相比，转染poFUT1cDNA的滋养细胞迁移能力明显增强，转染poFUT1siRNA组滋养细胞迁移能力降低。4.Westernblot检测血管生成相关蛋白的表达实验方法：具体步骤如上述Westernblot检测poFUT1cDNA、poFUTIsiRNA的转染效率实验步骤，区别在于一抗使用鼠抗人CD311：1000；兔抗人CD341：1000；兔抗人VEGFR21：1000；兔抗人VE-cadherin1：1000。结果：如图1D所示，转染poFUT1cDNA组，血管相关标志物CD31、CD34和血管生成相关蛋白VE-cadherin、VEGFR2的表达显著增加，滋养细胞的成管能力显著增强。5.小管形成实验1预先将基质胶置于4℃下解冻，并对实验所需的枪头进行预冷。2用预冷的枪头，将基质胶与PBS以1：1轻柔混匀，尽量减少气泡的产生，迅速将基质胶置于96孔板中，并在细胞培养箱中孵育1h。3将实施例1转染处理后的细胞更换为含有CellTrackerTMGreenCMFDA染料的培养基，在培养箱中培养15～30min。4用PBS洗涤3次，用0.25％胰蛋白酶消化，以800rpmmin离心5～8min，弃去上清液。5细胞悬浮于无血清培养基中，使细胞密度约为5×104mL，将细胞置于固化的基质胶上并置于培养箱中。孵育3h后，在显微镜下观察小管形成。实验结果如图1E所示，结论与上述Westernblot检测血管生成相关蛋白的表达实验结果一致。实施例3O-Fucose试剂盒检测滋养细胞表面总O-岩藻糖的表达实验1将实施例1转染处理的细胞培养液弃掉，更换为25～50μM浓度炔烃叠氮化合标记物的培养液，继续培养24～48h。2将细胞从培养箱中取出，PBS洗3次，每次5min。3加裂解液1％SDS，50mMTris-HCl，pH8.0200μL，反复吹打，冰上孵育15～30min，放于1.5mL的EP管中，超声1～2s，涡旋5min。44℃，13000～18000gmin，离心5min，将上清移至新的EP管中，BCA测定蛋白浓度，-20℃备用。5按下表加入各成分，涡旋5s。6加入CopperIIsulfateCuSO4ComponentB10μL，涡旋5s。7加入reactionbufferadditive1ComponentC10μL，涡旋5s，室温静置2～3min。8加入reactionbufferadditive2ComponentD20μL，涡旋5s，此时发现液体变为橙色，继续涡旋25min。9加入甲醇600μL，混匀，简短震荡。10加入氯仿150μL，简短震荡。11加入去离子水400μL，简短震荡。124℃，13000～18000gmin离心5min，小心将上清移至一新的EP管，橙色部分收集保存。13上清中加甲醇450μL，混匀，简短震荡。然后以4℃，13000～18000gmin离心5min，弃上清。14重复步骤13一次，去掉残余反应成分。15得到的沉淀溶于20μL的蛋白裂解液中，通过实施例3Westernblot实验检测HTR-8SVneo表面O-Fucose的表达。结果：如图2所示，poFUT1是蛋白质O-岩藻糖基转移酶，转染poFUT1siRNA，滋养细胞中总O-岩藻糖表达降低，而在此基础上转染poFUT1cDNA可以回调O-岩藻糖的合成。实施例4poFUT1通过增加滋养层细胞O-岩藻糖基化的合成促进其增殖、迁移和血管形成1.细胞周期蛋白的Westernblot实验方法；实验步骤同实施例2中Westernblot实验步骤，区别点在于一抗使用鼠抗人p211:500；鼠抗人p271:500；兔抗人CDK21:1000；兔抗人CDK61:1000；兔抗人cyclinD11:1000；兔抗人cyclinE21:1000；兔抗人PCNA1：1000。结果：细胞周期蛋白的Westernblot实验结果如图3A所示，转染poFUT1cDNA可以促进滋养层细胞的增殖。2.Transwell实验方法；实验步骤同实施例2中Transwell实验步骤，区别点在于此实验中细胞分别转染poFUT1cDNA和poFUT1mutant处理。结果：Transwell实验结果如图3B所示，转染poFUT1cDNA，滋养层细胞的迁移能力明显增强，而转染poFUT1mutant组，滋养细胞的迁移能力降低。3.小管形成实验方法；实验步骤同实施例2中小管形成实验步骤，区别点在于此实验中细胞分别转染poFUT1cDNA和poFUT1mutant处理。结果：小管形成实验结果如图3C所示，转染poFUT1cDNA，滋养层细胞的成管能力明显增强，而转染poFUT1mutant组，滋养层细胞的成管能力明显低于poFUT1cDNA组。4.RhoA信号通路的Westernblot实验方法；实验步骤同实施例2中Westernblot实验步骤，区别点在于一抗使用兔抗人LIMK1：1000；兔抗人p-LIMK1：1000；兔抗人cofilin1：1000；兔抗人p-cofilin1：1000；兔抗人RhoA1：500；兔抗人p-RhoA1：2000。二抗仅用HRP标记的二抗羊抗兔IgG1：3000。结果：RhoA信号通路的Westernblot实验结果如图3D所示，转染poFUT1cDNA，RhoA-GTP、p-LIMK和p-cofilin表达增强。而加RhoA信号通路抑制剂C3transferase，上述蛋白的磷酸化水平显著降低。实施例5鸡胚绒毛尿囊膜实验1受精蛋购买于北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。置于温度为37.8℃，湿度为70％～75％的生物孵化箱中孵化培养。2取8日胚龄的鸡胚，在检卵灯下观察血管的发育情况，并用铅笔标明气室的位置。3用70％的酒精消毒气室的顶部及四周，并用磨卵器在气室顶部磨一个方形裂痕，除去蛋壳造成“蛋窗”。4轻轻将“蛋窗”处的壳膜撕掉，勿伤及下面的绒毛尿囊膜，将消毒处理过的硅胶环直径＝0.5cm，高＝0.2cm置于毛细血管分布密集且避开大血管处，将PBS、人绒毛组织或经poFUT1siRNA5nM处理的人绒毛组织分别置于硅胶环内。5用无菌胶布封口，将胚胎置于敷箱中继续培养。6孵育72小时后，用无菌镊子扩大开口处，用数码相机拍摄硅胶环及其周围的区域，并在imageJ分析血管数量。实验结果如图4所示，与PBS处理组相比，加绒毛组织处理组尿囊膜上毛细血管分布和充血状显著增强。而绒毛组织经poFUT1siRNA处理后，与未经处理绒毛组相比，血管分支减少，充血状态降低。SEQUENCELISTING大连医科大学poFUT1在制备胎盘血管生成药物和RhoA信号通路激活剂药物中的应用20192PatentInversion3.51583DNA人工序列Artificial1atgggcgccgccgcgtgggcacggccgctgagcgtgtctttcctgctgctgcttctgccg60ctcccggggatgcctgcgggctcctgggacccggccggttacctgctctactgcccctgc120atggggcgctttgggaaccaggccgatcacttcttgggctctctggcatttgcaaagctg180ctaaaccgtaccttggctgtccctccttggattgagtaccagcatcacaagcctcctttc240accaacctccatgtgtcctaccagaagtacttcaagctggagcccctccaggcttaccat300cgggtcatcagcttggaggatttcatggagaagctggcacccacccactggccccctgag360aagcgggtggcatactgctttgaggtggcagcccagcgaagcccagataagaagacgtgc420cccatgaaggaaggaaacccctttggcccattctgggatcagtttcatgtgagtttcaac480aagtcggagctttttacaggcatttccttcagtgcttcctacagagaacaatggagccag540aggcgtgagaatcactcctgtgttaccttactcttcccaaggt58321167DNA人工序列Artificial2atgggcgccgccgcgtgggcacggccgctgagcgtgtctttcctgctgctgcttctgccg60ctcccggggatgcctgcgggctcctgggacccggccggttacctgctctactgcccctgc120atggggcgctttgggaaccaggccgatcacttcttgggctctctggcatttgcaaagctg180ctaaaccgtaccttggctgtccctccttggattgagtaccagcatcacaagcctcctttc240accaacctccatgtgtcctaccagaagtacttcaagctggagcccctccaggcttaccat300cgggtcatcagcttggaggatttcatggagaagctggcacccacccactggccccctgag360aagcgggtggcatactgctttgaggtggcagcccagcgaagcccagataagaagacgtgc420cccatgaaggaaggaaacccctttggcccattctgggatcagtttcatgtgagtttcaac480aagtcggagctttttacaggcatttccttcagtgcttcctacagagaacaatggagccag540agattttctccaaaggaacatccggtgcttgccctgccaggagccccagcccagttcccc600gtcctagaggaacacaggccactacagaagtacatggtatggtcagacgaaatggtgaag660acgggagaggcccagattcatgcccaccttgtccggccctatgtgggcattcatctggcc720attggctctgactggaagaacgcctgtgccatgctgaaggacgggactgcaggctcgcac780ttcatggcctctccgcagtgtgtgggctacagccgcagcacagcggcccccctcacgatg840actatgtgcctgcctgacctgaaggagatccagagggctgtgaagctctgggtgaggtcg900ctggatgcccagtcggtctacgttgctactgattccgagagttatgtgcctgagctccaa960cagctcttcaaagggaaggtgaaggtggtgagcctgaagcctgaggtggcccaggtcgac1020ctgtacatcctcggccaagccgaccactttattggcaactgtgtctcctccttcactgcc1080tttgtgaagcgggagcgggacctccaggggaggccgtcttctttcttcggcatggacagg1140ccccctaagctgcgggacgagttctga1167

权利要求：1.poFUT1在制备血管生成药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血管为胎盘血管。3.poFUT1在制备RhoA信号通路激活剂中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述激活剂包括含有poFUT1基因的质粒或含有poFUT1基因的蛋白。

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