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申请/专利权人：中国林业科学研究院林产化学工业研究所

摘要：一种黑曲霉及其在发酵橡实制备柠檬酸中的应用，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2016年9月12日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC12961。本发明应用常压室温等离子体诱变ARTP技术诱变筛选得到的黑曲霉AspergillusnigerAA120具有高产柠檬酸及单宁酶能力，可用于以橡实为原料发酵制备柠檬酸，为柠檬酸的制备提供了新的原料及技术选择。

主权项：1.黑曲霉（Aspergillusniger）AA120，其特征在于该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2016年9月12日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.12961。

全文数据：一种黑曲霉及其在发酵橡实制备柠檬酸中的应用技术领域本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种黑曲霉AspergillusnigerAA120及其在以橡实为原料发酵制备柠檬酸中的应用。背景技术橡实是壳斗科植物种子的总称。全世界有8属900余种，我国占7属水青冈属、栗属、栲属、石栎属、三棱栎属、青冈属和栎属300余种，是林区许多混交林的建群种，分布广泛。我国共有橡实林0.13-0.17亿公顷，年产橡实估计在60-70亿千克。橡实种仁含有丰富的营养成分：粗淀粉50％-60％、可溶性糖2％-8％、蛋白质3％-6％、粗纤维3％-5％、粗脂肪1％-5％、单宁5％-12％。葡萄牙和西班牙是世界橡树产业最发达的国家，已实现对橡树林木规模化、科学化的管护培育。朝鲜半岛森林覆盖面积占总面积的73％，也是对橡实研究最为重视的区域。韩国的研究集中在汉城大学、国立大学和朝鲜大学，他们进行淀粉分类，理化性质及其它成分对淀粉性质的影响等应用基础研究，将橡实淀粉用于食品工业及饲料工业。在我国，橡实作为目前有大量生产潜力而未大规模利用的林产原料，其研究报导较少，生产开发尚处于起步阶段，目前以野生橡实为原料制备柠檬酸等化学品的研究较少，国外也鲜有报道。柠檬酸又称枸缘酸，化学名称2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸。柠檬酸是世界上以生物化学方法生产量最大的有机酸，其用途非常广泛。在食品工业中可做为食品的酸味剂，抗氧化剂，pH调节剂，用于清凉饮料、果酱、水果和糕点等食品中；在医药工业中主要用作抗凝血剂、解酸药、矫味剂、化妆品等；在化学工业中可用作缓冲剂、络合剂、金属清洗剂、媒染剂、胶凝剂、调色剂等；此外也被广泛用于电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域中。目前，生产柠檬酸的方法有三种。首先是天然提取法，很多蔬菜和水果中都含有大量的天然柠檬酸，但这种方法需要大量新鲜原料、成本很高、产量又很低，因此未能得到广泛的应用；其次是化学合成法，而化学合成法大多很难避免使用有毒的化学试剂，很难应用于食品生产，并且合成步骤繁琐、原料较贵，因此这种方法也不具有竞争力；最后是生物发酵法，因为其工艺成熟、成本低廉、产量大。所以，目前市场上90％以上的柠檬酸都是通过生物发酵法生产的，柠檬酸是世界上产量最大的发酵产品之一。传统的柠檬酸生产主要以薯干为原料直接发酵生产柠檬酸，由于原料粗放，不添加任何氮源和无机盐及产酸促进剂，产酸一般在12％～13％之间，转化率为95％。发酵醪较粘稠，设备利用率较低，而且成熟发酵醪中除了含有柠檬酸外，尚含有大量的杂质，给后提取和产品质量的提高带来困难。近年来由于薯干大幅度涨价，且掺杂使假严重，使得一些柠檬酸生产企业难以承受。玉米去渣发酵工艺从1995年开始被一些原料产地厂家所使用，该工艺克服了薯干原料的某些弊端，为农副产品深加工找到一条出路。但产酸水平比较低，在11％左右，发酵粮耗比薯干高15％左右，转化率低于薯干3～5个百分点而且增加了液化后过滤这一环节，增加了能耗，大量滤渣处理起来也比较困难。为了克服薯干、玉米等原料发酵的缺点，探寻原料的多样化是柠檬酸产业发展的有效途径。利用橡实代替粮食作物生产化学品不仅可以节省粮食，增加农民收入，还可以提高森林资源的加工利用水平，实现橡子资源的综合利用，延伸林业产业链。我国每年有大约2000万吨的农林淀粉资源、数百万吨的木本油脂资源，以及80万吨的松脂资源，随着农林业的发展，其数量还将大幅度增加。可以预见，生物质资源利用将是21世纪化学品产业领域拓展研究的主要方向。黑曲霉是重要的发酵工业菌种，可生产柠檬酸、淀粉酶、酸性蛋白酶等多种产品，其中全球80％的柠檬酸是由黑曲霉发酵得到的。此外黑曲霉还可以产生单宁酶，而橡实中含有5％-12％的单宁，经浸提后还是会有单宁残留，所以在应用黑曲霉对橡实进行发酵制备柠檬酸的同时还可以对残留单宁进行降解，从而解除单宁对发酵体系中菌种和酶等活性物质的抑制作用。黑曲霉作为传统的发酵工业菌种，对其进行菌种改良从未停止过，近年来针对其单宁酶产量的提高也开展了很多诱变育种工作，但是以同时提高柠檬酸和单宁酶的产量为目标的诱变筛选，并将其用于以橡实为原料发酵制备柠檬酸的研究还未见报道。常压室温等离子体ARTP是近几年发展起来的一种新型的等离子体诱变源，已成功应用于多种微生物菌种的诱变选育中，ARTP可以在常压下产生多种分布均匀的高活性粒子，并瞬间作用于微生物细胞内的DNA物质上，引起DNA物质的损伤，并通过不完全的修复过程引起基因位点突变；产生的等离子温度接近室温，可以避免温度过高对微生物造成的热损伤；另外，ARTP设备简单、操作简易、运行成本较低。目前尚未发现应用ARTP技术同时提高黑曲霉产柠檬酸及单宁酶产量的报道。本发明利用常压室温等离子体诱变技术，筛选出一株高产柠檬酸及单宁酶的黑曲霉，提高了以橡实为原料发酵制备柠檬酸的产量，为柠檬酸产业的发展提供了一种新的原料来源。发明内容解决的技术问题：本发明的目的是提供一株高产柠檬酸及单宁酶突变菌株及其应用。即提供一种黑曲霉及其在发酵橡实制备柠檬酸中的应用。技术方案：黑曲霉AspergillusnigerAA120，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2016年9月12日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.12961。地址：北京市朝阳区北辰路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101上述黑曲霉AspergillusnigerAA120在发酵制备柠檬酸及单宁酶中的应用。上述黑曲霉AspergillusnigerAA120在以橡实为原料发酵制备柠檬酸中的应用。上述发酵用培养基为橡实仁粉酶解液培养基或橡实皮壳酶解液培养基。上述发酵条件为发酵温度30℃，摇床转速250rmin。橡实仁粉发酵培养基是去除单宁的橡实仁粉酶解液，加入0.6gL的硫酸铵，定容，每50mL分装500mL三角瓶中，115℃下灭菌30min。橡实表壳发酵培养基是去除单宁的橡实表壳酶解液，加入2gL的硫酸铵，1gL的磷酸二氢钾，0.5gL的硫酸镁，115℃下灭菌30min。有益效果：本发明采用室温常压等离子体诱变方法获得，其发酵产柠檬酸和单宁酶的能力都得到了提高，采用该菌株以橡实为原料发酵制备柠檬酸，其产量比出发菌株的产量提高了21.12％，且该菌株发酵制备单宁酶的产量较出发菌株提高了16.83％；本发明也为柠檬酸产业的发展提供了一种新的原料来源。附图说明图1为室温常压诱变黑曲霉存活率曲线图；图2为黑曲霉突变率图；图3为黑曲霉发酵制备柠檬酸工艺流程示意图。具体实施方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明所说的常压指一个标准大气压。实施例1利用常压室温等离子诱变技术对黑曲霉Aspergillusniger进行诱变将出发菌株Aspergillusniger在PDA斜面进行活化培养3～5d，培养温度30℃，用10mL生理盐水将斜面孢子全部刮下，转移到150mL三角瓶中，在三角瓶中加入30个玻璃珠直径4mm，转速250rmin，震荡30min，将孢子打散，孢子悬液浓度大约为107个mL，取10μL孢子悬液涂布到金属载片表面，进行ARTP诱变。诱变处理距离为2mm，处理功率为120W，气流量10SLM，处理时间为0S、20S、40S、60S、80S、100S、120S、150S、180S及210S；诱变后的载片放入含1mL生理盐水的EP管中，震荡1min，将载片上的孢子洗脱下来，然后将诱变后的孢子悬液稀释涂平板，置于温度为30℃的培养箱中培养至长出单菌落，计数单菌落数目。根据单菌落数目统计菌株存活率，存活率曲线见图1，然后继续培养至成熟以备筛选。高产柠檬酸及单宁酶突变菌株的筛选本发明采用单宁梯度平板对菌种进行初筛，然后再通过柠檬酸发酵进行复筛，从而得到具有高产柠檬酸及单宁酶的突变菌株，各处理时间下的突变率见图2。含单宁无糖察氏培养基的配制：硝酸钠3.0gL，磷酸氢二钾1.0gL，氯化钾0.5gL，硫酸镁0.5gL，硫酸亚铁0.01gL及不同浓度的水解单宁，121℃灭菌20min。挑取如上所述生长成熟的单菌落接于含0.3％、0.6％、0.9％、1.2％及1.5％水解单宁的无糖察氏固体培养基中逐级划线培养，并在30℃培养箱中震荡培养72h，挑选长势良好的菌种进行柠檬酸发酵试验。柠檬酸发酵培养基：葡萄糖15gL，硫酸铵2.0gL，磷酸二氢钾1.0gL，硫酸镁0.25gL，115℃灭菌30min，发酵温度30℃，转速250rmin。以橡实仁粉为原料发酵制备柠檬酸将橡实风干后脱壳，橡实仁粉碎后过40目筛得到橡实仁粉原料；采用水提法去除橡实仁粉中的单宁，条件为橡实仁粉用10倍质量的水在室温下浸提，定时搅拌，每隔6h换水一次，浸提5～6次后抽滤并烘干，使得橡实仁粉中的单宁含量降至1.0％。将0.20kgL去除单宁的橡子粉调浆后水浴保温至50℃左右，加入高温α淀粉酶和无水氯化钙，于水浴锅中加热升温至90℃，并保温60min，至淀粉完全分解，加入0.6gL硫酸铵，灭菌后作为橡子淀粉发酵柠檬酸的培养基；将黑曲霉成熟孢子接入发酵培养基中进行发酵，在发酵温度为30℃，转速为220rmin的条件下发酵90h，发酵液中柠檬酸的酸度可以达到14.05g100mL，与目前以木薯和玉米为原料发酵制备柠檬酸的产量相当，出发菌株Aspergillusniger和本发明的黑曲霉AA120发酵结果见表1。表1出发菌株Aspergillusniger和本发明的黑曲霉AA120发酵结果菌种产酸g100mL糖酸转化率％发酵时间hAspergillusniger11.6077.33120AA12014.0593.67100以橡实皮壳为原料发酵制备柠檬酸将橡实皮壳烘干，并用粉碎机粉碎过40目筛得到橡实皮壳粉原料，采用水提法去除橡实皮壳粉中的单宁，条件为橡实皮壳粉用10倍质量的水在室温下浸提，定时搅拌，每隔6h换水一次，浸提5～6次后抽滤并烘干，使得橡实皮壳粉中的单宁含量降至1.0％。采用2％的NaOH处理橡实皮壳，固液比1﹕10wv，gmL，在高压蒸汽灭菌锅中121℃0.15Mpa处理30min。处理结束后，用蒸馏水将原料洗至中性，过滤，所得部分固体预处理原料进行酶水解。酶解条件为：固液比5％wv，gmL，于50℃水浴中预热20min，加入酶，于50℃，150rmin水解72h。将橡实皮壳酶解液，NH42SO42kgL，KH2PO41kgL，MgSO40.5kgL，灭菌后作为橡子壳酶解液发酵柠檬酸的培养基。在橡实皮壳酶解液发酵培养基中接入黑曲霉成熟孢子进行柠檬酸发酵。在发酵温度为30℃，转速为220rmin的条件下发酵90h，发酵液中柠檬酸的酸度可以达到2.28～3.46g100mL。菌株的培养方法所得到的黑曲霉AspergillusnigerAA120适于用PDA固体培养基培养及保存。该菌株可以在含0.5wt.％～0.8wt.％单宁的培养基上生长，同时保留稳定的发酵产柠檬酸的特性。发酵产物的分析柠檬酸酸度测定采用酸度滴定法：将过滤液充分摇匀，用吸管吸取10mL放入150mL三角瓶中，加2滴酚酞指示剂，用0.1molLNaOH滴定酸度。对照亦按同法滴定。二者消耗NaOH毫升数的差额乘以0.64，即得柠檬酸的酸度g100mL。计算公式：式中C柠檬酸――柠檬酸酸度g100mL；CNaOH――NaOH标准溶液浓度molL；V滴定发酵液――滴定发酵液所用的0.1molLNaOH标准溶液体积mL；V滴定对照――滴定对照所用的0.1molLNaOH标准溶液体积mL。

权利要求：1.黑曲霉（Aspergillusniger）AA120，其特征在于该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2016年9月12日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.12961。2.权利要求1所述黑曲霉（Aspergillusniger）AA120在发酵制备柠檬酸及单宁酶中的应用。3.权利要求1所述黑曲霉（Aspergillusniger）AA120在以橡实为原料发酵制备柠檬酸中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵用培养基为橡实仁粉酶解液培养基及橡实皮壳酶解液培养基。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵条件为发酵温度30℃，摇床转速250rmin。

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