买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：江南大学附属医院

摘要：本发明提供的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株命名为GIST‑FR，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCNO：C2017111。同时本发明还提供了这一细胞株的构建方法以及该细胞株作为人胃肠道间质瘤耐药机制的探讨及其相关信号通路研究的细胞模型的用途，采用组织块培养法获取GIST原代细胞，并进行永生化，建立GIST‑F细胞系，随后对其进行Imatinib耐药诱导，建立Imatinib耐药的GIST细胞株GIST‑FR。GIST‑FR细胞已体外传代40余代，较GIST‑F细胞生长慢，对Imatinib的IC50显著增高，耐药指数为3.52P＜0.01；全外显子组测序结果显示GIST‑FR细胞KIT和PDGFRA均阴性。本发明从人GIST原代组织成功建立GIST细胞系，并进一步诱导获得其Imatinib耐药细胞，为GIST发病机制及耐药相关研究奠定了基础。

主权项：1.一种Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株，命名为GIST-FR，保藏于中国典型培养物保藏中心，其细胞株的保藏编号CCTCNO：C2017111。

全文数据：Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株及其构建方法和应用技术领域[0001]本发明涉及耐药细胞株及其构建方法和应用，尤其涉及一种Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株及其构建方法和应用。背景技术[0002]GIST胃肠道间质瘤）是胃肠道中最常见的间叶性肿瘤，约占胃肠道恶性肿瘤的1%〜3%。研究发现，约85%的胃肠道间质瘤的131'存在111'65%或1^6?1^20%基因突变。KIT和PDGFRA都属于跨膜ΙΠ型酪氨酸受体家族。[0003]目前，关于胃肠道间质瘤GIST的发病机制、病理诊断、临床治疗等方面的研究都取得了很大的进步，酪氨酸激酶抑制剂，主要是伊马替尼（Imatinib等分子靶向药物的应用，极大的提高了胃肠道间质瘤GIST的临床疗效。但伊马替尼（Imatinib不能完全根除胃肠道间质瘤GIST，部分患者在接受伊马替尼（Imatinib治疗两年内出现继发耐药，耐药成为影响伊马替尼（Imatinib疗效的关键因素之一。[0004]目前，国外已建立的较为经典的胃肠道间质瘤GIST细胞株很少，如GIST-882、GIST-Tl等，且均存在KIT突变。但是，未见针对国人建立胃肠道间质瘤GIST细胞株的报道，且没有KIT和PDGFRA野生型GIST细胞。为此，从人原代GIST肿瘤组织构建了一株永生化GIST细胞系，并进一步构建了其伊马替尼（Imatinib耐药细胞株，经全外显子组测序为KIT和PDGFRA野生型，以期为研究胃肠道间质瘤GIST发病机制及耐药机制提供基础。发明内容[0005]针对上述存在的问题，本发明提供一种Imatinib耐药的KIT和I3DGFRA野生型GIST细胞株及其构建方法和应用，以克服目前国内未建立伊马替尼耐药的KIT和TOGFRA野生型GIST耐药细胞株导致研究GIST发病机制及耐药机制较为困难的问题，从而为GIST耐药相关研究奠定基础，加大国家在国际医学上的影响力。[0006]为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：[0007]一种Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株，命名为GIST-FR，保藏于中国典型培养物保藏中心，其细胞株的保藏编号CCTCN0:C2017111，保藏日期为2017年8月16日，保藏单位地址为湖北省武汉市武汉大学，分类命名为：GastrointestinalCglulaTumoreCellulis0[0008]上述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株，其中，所述Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株经全外显子组测序，结果显示其KIT和PDGFRA均无突变，其细胞形态呈短梭形。。[0009]上述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株，其中，所述Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株耐药前IC50为15.91，耐药后IC50为55.95，耐药指数为3.52。[0010]上述的Imatinib耐药的KIT和I3DGFRA野生型GIST细胞株，其中，所述Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株为KIT和PDGFRA野生型。[0011]上述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株作为人胃肠道间质瘤耐药机制的探讨及其相关信号通路的研究的细胞模型的用途。[0012]上述的伊马替尼耐药的GIST耐药细胞株的构建方法，其中，包括以下步骤：[0013]1原代GIST细胞的获得[0014]取手术切除的新鲜人胃肠道间质瘤GIST组织，剔除周围坏死组织及粘膜后，分别用含5%双抗的PBS和1640培养液洗涤3次;剪成Imm3小组织块;取所述小组织块接种于胶原包被后的六孔板中，放置于37°C培养箱中培养，8小时后各孔加200yL含20%FBS的1640培养液;第二天换液，将新的200yL含20%FBS的1640培养液换至六孔板中，以后每两天换一次培养液，直至细胞爬出所述小组织块生长至局部密集；[0015]2永生化GIST细胞GIST-F的构建[0016]采用pLVX-IRES-Ne〇-SV40largeT和pLOX-TERT-iresTK慢病毒质粒分别进行慢病毒包装；待细胞爬出所述小组织块生长至局部密集时，去除所述小组织块，再用PLVX-IRES-Ne〇-SV40largeT和pLOX-TERT-iresTK两种病毒共同感染GIST细胞，命名为GIST-F;6小时后换液，将新的2mL含20%FBS的1640培养液换至六孔板中；之后扩大培养并进行细胞鉴定；用定量RT-PCR方法检测SV40largeT的基因表达，SV40largeT引物序列为F-5’AAGCATTGCCTGGAACGCA3’，R-5’TCAGCCACAGGTCTGTACCA3’；[0017]3伊马替尼耐药细胞株GIST-FR的建立[0018]采用逐步递增伊马替尼浓度的方法诱导GIST-F细胞耐药;待细胞进入对数生长期后，从IC50的120开始加药诱导，常规传代，等细胞耐受后，逐步提升药物浓度;直到细胞在3倍IC50以上的药物浓度中可稳定生长，将其命名为GIST-FR。[0019]上述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株的构建方法，其中，步骤⑴中所述胶原的浓度为200ugmL。[0020]上述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株的构建方法，其中，步骤⑴中，当所述小组织块在所述六孔板中贴壁牢固后，所换的培养液为2mL含20%FBS的1640培养液。[0021]本发明提供了一种Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株，命名为GIST-FR，保藏于中国典型培养物保藏中心，其细胞株的保藏编号CCTCNO:C2017111。同时本发明还提供了这一细胞株的构建方法以及该细胞株作为人胃肠道间质瘤耐药机制的探讨及其相关信号通路的研究的细胞模型的用途，采用组织块培养法获取GIST原代细胞，并进行永生化，建立GIST-F细胞系，随后对其进行Imatinib耐药诱导，建立Imatinib耐药的GIST细胞株GIST-FR.GIST-FR细胞已体外传代40余代，较GIST-F细胞生长慢，对Imatinib的IC50显著增高，耐药前IC50为15.91，耐药后IC50为55.95,耐药指数为3.52P0.01;全外显子组测序结果显示GIST-FR细胞KIT和TOGFRA均阴性。本发明从人GIST原代组织成功建立GIST细胞系，并进一步诱导获得其Imatinib耐药细胞，为GIST耐药相关研究奠定了基础。附图说明[0022]通过阅读参照以下附图对非限制实施例所作的详细描述，本发明及其特征、外形和优点将会变得更加明显，在全部附图中相同的标记指示相同的部分，并未刻意按照比例绘制附图，重点在于示出本发明的主旨。[0023]图1是显微镜下的原代细胞、永生化细胞和Imatinib耐药细胞GIST-FR的示意图；[0024]图2是GIST-FR来源的肿瘤组织的⑶117和D0G-1表达及耐药前永生化细胞的⑶117表达的不意图；[0025]图3是GIST-FR细胞Imatinib药物敏感试验及生长曲线的示意图；[0026]图4是GIST-FR细胞的细胞周期的示意图；[0027]图5是对GIST-FR进行了KIT和PDGFRA常见外显子突变的验证示意图。具体实施方式[0028]下面结合附图和具体的实施例对本发明作进一步的说明，但是不作为本发明的限定。[0029]实施例1:[0030]本发明实施例1提供的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株，命名为GIST-FR，保藏于中国典型培养物保藏中心，其细胞株的保藏编号CCTCN0:C2017111，保藏日期为2017年8月16日，保藏单位地址为湖北省武汉市武汉大学，分类命名为：GastrointestinalCelulaTumoreCellulis0[0031]本发明实施例1提供的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株中，伊马替尼耐药的GIST细胞株GIST-FR细胞已经体外传代40余代;细胞形态呈短梭形;KIT和PDGFRA均不存在突变;GIST-FR细胞较非耐药裸细胞生长慢，对Imatinib的IC50显著增高，耐药指数为3.52卩0.01;耐药前后细胞周期分别为6061期（24.59±5.63%^44.76±2.11%，5期阳9.60±4.53%¥852.64±0.60%，62]«期（5.82±1.10%¥82.60±1.50%Ρ0·05。[0032]本发明实施例1提供的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株可作为人胃肠道间质瘤耐药机制的探讨及其相关信号通路的研究的细胞模型的用途。[0033]本发明实施例1提供的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株的构建方法，包括以下步骤：[0034]⑴原代胃肠道间质瘤GIST细胞的获得[0035]取手术切除的新鲜人GIST组织，剔除周围坏死组织及粘膜后，分别用含5%双抗的I3BS和1640培养液洗涤3次;剪成lmm3小组织块;取小组织块接种于浓度为200ugmL胶原包被后的六孔板中，放置于37°C培养箱中培养，8小时后各孔加200yL含20%FBS的1640培养液;第二天换液，将新的200yL含20%FBS的1640培养液换至六孔板中，以后每两天换一次培养液，直至细胞爬出小组织块生长至局部密集，其中，当小组织块在所述六孔板中贴壁牢固后，所换的培养液为2mL含20%FBS的1640培养液;200yL或者2mL是根据所选用的培养皿的规格确定的，本申请的权利要求书以及实施例中均采用的是六孔板，但是也可以根据需要选用12孔板或者24孔板等，此时所加入的培养液量就根据培养皿来确定；[0036]2永生化GIST细胞GIST-F的构建[0037]采用pLVX-IRES-Ne〇-SV40largeT和pLOX-TERT-iresTK慢病毒质粒分别进行慢病毒包装；待细胞爬出所述小组织块生长至局部密集时，去除所述小组织块，再用PLVX-IRES-Ne〇-SV40largeT和pLOX-TERT-iresTK两种病毒共同感染GIST细胞，命名为GIST-F;6小时后换液，将新的2mL含20%FBS的1640培养液换至六孔板中；之后扩大培养并进行细胞鉴定；用定量RT-PCR方法检测SV40largeT的基因表达，SV40largeT引物序列为F-5’AAGCATTGCCTGGAACGCA3’，R-5’TCAGCCACAGGTCTGTACCA3’；[0038]3伊马替尼耐药细胞株GIST-FR建立[0039]采用逐步递增伊马替尼浓度的方法诱导GIST-F细胞耐药;待细胞进入对数生长期后，从IC50的120开始加药诱导，常规传代，等细胞耐受后，逐步提升药物浓度;直到细胞在3倍IC50以上的药物浓度中可稳定生长，将其命名为GIST-FR。[0040]同时，本发明实施例1中还对耐药诱导前GIST细胞的鉴定、耐药细胞GIST-FR的形态学观察、生物学特性鉴定及基因突变检测，包括：[0041]①药物诱导前GIST细胞的鉴定[0042]GIST-F细胞来源于临床肿瘤组织，IHC检测结果显示该肿瘤组织呈⑶117阳性和D0G-1阳性参见图2-A;取制作好的GIST细胞爬片，Triton-XlOO通透20分钟;PBS洗3次，5分钟次;5%BSA封闭1小时，加CDl17抗体（1:100，4°C孵育过夜。第二天二抗孵育2小时；DAB显色5-10分钟，清水清洗，苏木素染色并清洗后封片。对照组为结直肠癌细胞HCT-116参见图2-B;从GIST细胞中提取蛋白，定量后，用Westernblot方法检测CD117蛋白表达。对照组为HCT-116细胞参见图2-C。[0043]②耐药细胞GIST-FR的形态学观察[0044]采用组织块培养法获取GIST原代细胞，十余天后细胞逐渐爬出组织块贴壁延伸生长，细胞呈长梭形（参见图1-A;经永生化处理，传5代后部分细胞开始凋亡，存活细胞形态逐步转变为短梭形，此后凋亡开始减少参见图1-B;经过8个月的Imatinib药物诱导培养，细胞形态变短，变圆，表面不光滑，并呈克隆状生长参见图1-C。[0045]③Imatinib耐药细胞株GIST-FR药物敏感性分析及细胞增殖实验[0046]取对数生长期细胞，以3000个孔接种于96孔板，设3个复孔，24小时后加入4、8、16、32、64ugmL的Imatinib，并设无药对照组。48小时后用CCK-8法测定0D450值。细胞活力%=加药组OD值对照组OD值）X100%。绘制细胞浓度效应曲线。GIST-FR对Imatinib敏感性较GIST-F细胞显著降低，两者IC50分别为55.95ygmL和15.91ygmL，耐药指数为3.52P0.01参见图3-A，表明Imatinib耐药细胞GIST-FR构建成功。随后对两株细胞的增殖情况进行了比较;以2000个孔接种于96孔板，设置3个复孔，利用CCK-8方法绘制细胞增殖曲线，发现GIST-FR较GIST-F细胞增殖速度显著减慢P0.01，参见图3-B;[0047]④流式细胞仪检测Imatinib耐药细胞株GIST-FR的细胞周期[0048]由于GIST-FR的生长速度较亲本细胞GIST-F明显减慢，随后对两株细胞的细胞周期进行检测。收集对数生长期细胞，预冷的PBS洗2次，用95%的-20°C预冷乙醇固定细胞过夜，离心弃上清，预冷的PBS洗2次，重悬细胞，加入碘化丙啶PI，37°C避光孵育30分钟后用BDFACSCancoΠ流式细胞仪检测细胞周期。其耐药前后细胞周期分别为:G0G1期（24.59土5.63%vs44·76±2·11%，S期^9.60±4.53%vs52.64±0.60%，G2M期（5.82土1.10%vs2.60±1.50%。耐药细胞GIST-FR的G0G1期细胞比例上调，S期和G2M期细胞比例下调（图4，差异有统计学意义P0.05，表明耐药细胞株进入静止期的细胞增多，从而促进细胞耐药。[0049]⑤Imatinib耐药细胞株GIST-FR和耐药诱导前GIST细胞GIST-F的全外显子组测序。[0050]对GIST-FR和GIST-F进行了全外显子组测序，提取细胞DNA送上海伯豪生物技术有限公司进行检测，结果显示两种细胞株的KIT和TOGFRA均无突变。随后采用Sanger测序方法对GIST关键驱动基因（KIT和TOGFRA的常见外显子突变进行了进一步验证，包括KIT外显子9、11、13、17和PDGFRA外显子18,用康为柱式全基因组提取试剂盒提取GIST-F细胞DNA，用primerpremier6软件设计KIT外显子9、11、13、17和I3DGFRA外显子18的PCR引物（参见表2WCR扩增产物送上海生工生物工程股份有限公司测序分析。结果显示两株细胞以上外显子均无突变参见图5，为GIST-FR细胞sanger测序验证结果）。。[0051][0052]表2.KIT和PDGFRA各外显子引物信息[0053]在本发明实施例1中，采用组织块培养法获取GIST原代细胞，十余天后细胞逐渐爬出组织块贴壁延伸生长，细胞呈长梭形参见图1-A、B。利用SV40IargeT和TERT慢病毒对原代GIST细胞两次感染，进行永生化处理。传5代后部分细胞开始凋亡，存活细胞形态逐步转变为短梭形，此后凋亡开始减少。检测GIST-F细胞中SV40IargeT的表达，结果显示GIST-F细胞中SV40IargeT高表达，而未永生化对照细胞无表达，表明SV40IargeT已经稳定整合到GIST细胞基因组上并能持续表达。现永生化GIST-F细胞已经体外传代40余代，状态良好，表明GIST-F细胞构建成功。[0054]对GIST-F细胞进行的细胞鉴定:GIST主要根据形态学特征结合免疫表型（CD117、D0G-1等进行诊断，必要时进行基因突变检测。GIST-F细胞来源于临床肿瘤组织，IHC检测结果显示该肿瘤组织呈⑶117阳性和D0G-1阳性参见图2-A;与此一致，永生化的GIST-F细胞⑶117染色也呈阳性，阴性对照组NC不表达⑶117参见图2-BJesternbolt检测进一步证实永生化的GIST-F细胞表达⑶117参见图2-C。随后采用浓度梯度递增的方法对GIST-F细胞进行了Imatinib耐药诱导。经过8个月的药物诱导培养，细胞形态变短，变圆，表面不光滑，并呈克隆状生长，命名为GIST-FR。发现GIST-FR细胞株有以下特点：细胞形态变短，变圆，表面不光滑，并呈克隆状生长参见图1-C;药物敏感性分析显示，GIST-FR对Imatinib敏感性较GIST-F细胞显著降低，两者IC50分别为55.95ygmL和15.91ygmL，耐药指数为3.52P0.01参见图3-A;随后对两株细胞的增殖情况进行了比较，发现GIST-FR较GIST-F细胞增殖速度显著减慢P0.01，参见图3-B;由于GIST-FR的生长速度较亲本细胞GIST-F明显减慢，随后对两株细胞的细胞周期进行检测，其耐药前后细胞周期分别为：G0G1期（24.59±5.63%vs44.76±2.11%，S期（69·60±4·53%vs52·64±0·60%，G2M期（5.82±1.10%vs2·60±1·50%。耐药细胞GIST-FR的G0G1期细胞比例上调，S期和G2M期细胞比例下调（参见图4，差异有统计学意义P0.05，表明耐药细胞株进入静止期的细胞增多，从而促进细胞耐药。随后对GIST-F和GIST-FR细胞进行了全外显子组测序，并采用Sanger测序方法对两株细胞GIST关键驱动基因KIT和TOGFRA的常见外显子突变进行了进一步验证，包括KIT外显子9、11、13、17和^6?1^外显子18，结果显示以上外显子均无突变参见图5，为GIST-FR细胞sanger测序验证结果）。[0055]所以，本发明实施例1提供的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株，命名为GIST-FR，保藏于中国典型培养物保藏中心，其细胞株的保藏编号保藏编号CCTCNO:C2017111。同时本发明还提供了这一细胞株的构建方法以及该细胞株作为人胃肠道间质瘤耐药机制的探讨及其相关信号通路的研究的细胞模型的用途，采用组织块培养法获取GIST原代细胞，并进行永生化，建立GIST-F细胞系，随后对其进行Imatinib耐药诱导，建立Imatinib耐药的GIST细胞株GIST-FR.AIST-FR细胞已体外传代40余代，较GIST-F细胞生长慢，对Imatinib的IC50显著增高，耐药前IC50为15.91，耐药后IC50为55.95,耐药指数为3.52P0.01;全外显子组测序结果显示GIST-F和GIST-FR细胞KIT和I3DGFRA均阴性。本发明从人GIST原代组织成功建立GIST细胞系，并进一步诱导获得其Imatinib耐药细胞，为GIST耐药相关研究奠定了基础。[0056]本领域技术人员应该理解，本领域技术人员结合现有技术以及上述实施例可以实现所述变化例，在此不予赘述。这样的变化例并不影响本发明的实质内容，在此不予赘述。[0057]以上对本发明的较佳实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特点实施方式，其中未尽详细描述的设备和结构应该理解为用本领域中的普通方式予以实施;任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例，这并不影响本发明的实质内容，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案保护的范围内。

权利要求：1.一种Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株，命名为GIST-FR，保藏于中国典型培养物保藏中心，其细胞株的保藏编号CCTCNO:C2017111。2.如权利要求1所述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株，其特征在于，所述Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株的细胞形态呈短梭形。3.如权利要求1所述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株，其特征在于，所述Imatinib耐药的KIT和I3DGFRA野生型GIST细胞株耐药前IC50为15.91，耐药后IC50为55.95,耐药指数为3.52。4.如权利要求1所述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株，其特征在于，所述Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株为KIT和PDGFRA野生型。5.如权利要求1所述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株作为人胃肠道间质瘤发病和耐药机制的探讨及其相关信号通路的研究的细胞模型的用途。6.如权利要求1所述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：⑴GIST细胞的获得取手术切除的新鲜GIST组织，剔除周围坏死组织及粘膜后，分别用含5%双抗的PBS和1640培养液洗涤3次;剪成Imm3小组织块;取所述小组织块接种于胶原包被后的六孔板中，放置于37°C培养箱中培养，8小时后各孔加200yL含20%FBS的1640培养液;第二天换液，将新的200yL含20%FBS的1640培养液换至六孔板中，以后每两天换一次培养液，直至细胞爬出所述小组织块生长至局部密集；⑵永生化GIST细胞GIST-F的构建采用pLVX-IRES-Ne〇-SV40largeT和pLOX-TERT-iresTK慢病毒质粒分别进行慢病毒包装；待细胞爬出所述小组织块生长至局部密集时，去除所述小组织块，再用PLVX-IRES-Ne〇-SV40largeT和pLOX-TERT-iresTK两种病毒共同感染GIST细胞，命名为GIST-F;6小时后换液，将新的2mL含20%FBS的1640培养液换至六孔板中；之后扩大培养并进行细胞鉴定；用定量RT-PCR方法检测SV40largeT的基因表达，SV40largeT引物序列为F-5’AAGCATTGCCTGGAACGCA3’，R-5’TCAGCCACAGGTCTGTACCA3’；⑶伊马替尼耐药细胞株GIST-FR建立采用逐步递增伊马替尼浓度的方法诱导GIST-F细胞耐药;待细胞进入对数生长期后，从IC50的120开始加药诱导，常规传代，待细胞耐受后，逐步提升药物浓度;直到细胞在3倍IC50以上的药物浓度中可稳定生长，将其命名为GIST-FR。7.如权利要求6所述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株的构建方法，其特征在于，步骤⑴中所述胶原的浓度为200ugmL。8.如权利要求6所述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株的构建方法，其特征在于，步骤⑴中，当所述小组织块在所述六孔板中贴壁牢固后，所换的培养液为2mL含20%FBS的1640培养液。

百度查询： 江南大学附属医院 Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株及其构建方法和应用