买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：光明乳业股份有限公司

摘要：本发明公开了一种富含果聚糖levan的发酵乳饮料的制备方法，其包括如下步骤：1将柠檬明串珠菌Leuconostoccitreum发酵菌种在脱脂乳蔗糖培养基中发酵培养，得发酵乳；2将所得发酵乳与含有甜味料和酸味剂的勾兑液混合，均质，灭菌即得。本发明采用的柠檬明串珠菌是乳酸菌的一种，与其他产levan的菌株，如芽孢杆菌等相比，其代谢产物具有更高的食品安全性。本发明的制备方法极大简化了生产步骤，节省了生产成本，同时降低了非连续性操作中带来的污染风险。该制备方法制备所得的发酵乳饮料的levan含量较高，质量稳定，打破了现有市场上稀缺以果聚糖levan作为功能性成分饮料的现状。

主权项：1.一株柠檬明串珠菌（Leuconostoccitreum）的菌株，其特征在于，所述菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNO.6431。

全文数据：一种富含果聚糖levan的发酵乳饮料及其制备方法本申请是申请日为2015年8月27日、申请号为201510534955.X、发明创造名称为“一种富含果聚糖levan的发酵乳饮料及其制备方法”的专利申请的分案申请。技术领域本发明属于生物技术领域，具体涉及一种富含果聚糖levan的发酵乳饮料及其制备方法。背景技术多糖polysaccharide是一种由单糖以糖苷键键合而成大分子聚合物，研究表明，多糖具有免疫调节、抗病毒、抗癌、降血糖、降血压等益生功能。自然界中的多糖主要分布于微生物、高等植物、动物、地衣以及藻类中，其中，微生物来源的多糖尤指其胞外多糖，为某些特定微生物如乳酸菌、土壤杆菌、根瘤菌等在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一类糖类化合物，其中，依附于微生物细胞壁外的多糖被称为荚膜多糖，而粘液多糖则以渗透于生长环境中的形式存在。果聚糖Levan是一种天然的果糖聚合物，存在于多种植物和微生物发酵产物中，虽然在甘蔗汁加工业中是不受欢迎的微生物代谢产物，但在抗癌、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、降胆固醇、增强免疫、减肥等医药临床领域具有极高的应用价值，近年来受到研究者的关注。有关levan的报道最早可追溯到20世纪30年代，至今相关研究已遍布产量优化、结构解析、作用机理、功能特性等多个领域，然而，纵观国内饮料市场，尽管各类功能性饮料丛生，如红牛补充能量、脉动补充维生素等，但以levan为主要功能成分的饮料几乎没有。而且，现有的含多糖饮料的相关研究报道，其涉及的多糖来源多为芽孢杆菌、产气杆菌等有害菌代谢获得，应用方式也都是人为添加于饮料中，具有一定应用风险的多糖来源与人为添加的应用方式使这类产品渐渐缺乏创新性与安全性。因此，利用安全性更高的微生物代谢脱脂乳蔗糖培养基来生产以果聚糖levan为功能性成分的发酵乳饮料，将是未来新型功能性饮料发展的趋势之一，该问题亟待解决。发明内容因此，本发明为了解决目前市场缺乏以levan为主要功能成分的发酵乳饮料，并且现有levan产生菌多为致病菌，以及类似饮料中多糖多为人工添加的问题，提供了一种富含果聚糖levan的发酵乳饮料及其制备方法。本发明人发现利用保藏编号为CGMCCNo.6431柠檬明串珠菌Leuconostoccitreum代谢脱脂乳蔗糖培养基后，所获得的发酵乳中含有大量果聚糖levan，该发酵乳经勾兑调味后的风味颇佳，能够被大部分消费者接受，从而完成了本发明。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是：一种富含果聚糖levan的发酵乳饮料的制备方法，该制备方法包括以下步骤：1将柠檬明串珠菌Leuconostoccitreum发酵菌种在脱脂乳蔗糖培养基中发酵培养，得发酵乳；2将步骤1所得发酵乳与含有甜味料和酸味剂的勾兑液混合，均质，灭菌即得。其中步骤1为将柠檬明串珠菌Leuconostoccitreum发酵菌种在脱脂乳蔗糖培养基中发酵培养，得发酵乳。其中所述的柠檬明串珠菌为现有技术，其制备方法为本领域常规制备方法，或者通过购买获得。所述柠檬明串珠菌Leuconostoccitreum发酵菌种较佳地为保藏号为CGMCCNO.6431的柠檬明串珠菌株，该菌株的命名为BD01707。该菌株已于2012年08月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。所述的脱脂乳蔗糖培养基的制备方法较佳地包括以下步骤：在蒸馏水中加入6～12％的脱脂乳粉和5～20％的蔗糖，所述百分比为质量百分比，混匀充分溶解后，95～125℃灭菌5～20分钟，冷却即得。所述的培养的温度较佳地为25℃～35℃，更佳地为30℃，所述发酵培养更佳地为震荡发酵培养，振荡的速度较佳地为150～250rpm，更佳地为200rpm，培养时间较佳地为72h～110小时，更佳地为96小时，接种量较佳地为1.0％～3.0％，更佳地为2.0％，所述百分比为体积百分比。其中步骤2为将步骤1所得发酵乳与含有甜味料和酸味剂的勾兑液混合，均质，灭菌即得。其中所述的甜味料为本领域常规的甜味料，更佳地为白砂糖、糖浆和甜味剂中的一种或多种；其中，所述的甜味剂为阿斯巴甜、甜蜜素和安赛蜜中的一种或多种；所述的甜味料的含量为使所述的发酵乳饮料的甜度折合成蔗糖甜度为5％～10％；所述的酸味剂为本领域常规的酸味剂，较佳地为柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乳酸和醋酸中的一种或多种；所述的酸味剂的含量为使所述的发酵乳饮料的滴定酸度70°T～80°T。本发明所述甜味料和酸味剂的种类和使用量都符合中国食品添加剂相关法律法规的规定。其中所述的发酵乳与勾兑液的体积比例较佳地为1:0.69～1:2.02，更佳地为1:1.33～1:2.02，优选地为1:2.02。其中所述均质的压力较佳地为15～30MP，更佳地为20～28MP，优选地为25MP；所述灭菌的温度较佳地为95℃～125℃，更佳地为98～110℃，优选地为100℃；灭菌的时间为5分钟～20分钟，更佳地为10～18分钟，优选地为15分钟。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二是：一种如本发明所述的制备方法制得的富含果聚糖levan的发酵乳饮料。如上所述的发酵乳饮料，其中果聚糖levan的含量较佳地为≥0.5％，所述百分比为质量百分比。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：1、本发明采用的菌株为一株产果聚糖levan的柠檬明串珠菌Leuconostoccitreum，该菌株为首次发现具有产levan能力的柠檬明串珠菌。2、本发明采用的柠檬明串珠菌是乳酸菌的一种，与其他产levan的菌株如芽孢杆菌等相比，其代谢产物具有更高的食品安全性。3、本发明提供的发酵乳饮料中所含有的levan是柠檬明串珠菌代谢蔗糖产生的，与市面上以人工后添加方式生产的多糖饮料相比，本发明的制备工艺极大简化了生产步骤，节省了生产成本，同时降低了非连续性操作中带来的污染风险。4、本发明提供的发酵乳饮料，其制备所过程采用的发酵培养基来源广泛、成本低廉、天然安全，在降低物料成本的同时，提高了食品的安全性。5、本发明利用产果聚糖levan的柠檬明串珠菌发酵天然发酵培养基，结合勾兑、调味的方法生产可直接食用的功能性饮料，打破现有市场上稀缺以果聚糖levan作为功能性成分饮料的现状。生物材料保藏信息本发明涉及的柠檬明串珠菌的菌株，已于2012年08月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。该菌株的建议的分类命名为：柠檬明串珠菌Leuconostoccitreum，该菌株的保藏编号为：CGMCCNo.6431，所保藏的培养物名称为：BD01707。附图说明图1显示柠檬明串珠菌BD01707多糖的单糖组成色谱测定结果。图2显示柠檬明串珠菌BD01707多糖的红外光谱测定结果。图3显示柠檬明串珠菌BD01707多糖的核磁共振测定结果。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例1富含果聚糖levan的发酵乳饮料的制备1、材料与方法脱脂乳蔗糖培养基的制备：将质量百分比为10％的脱脂乳粉与15％的蔗糖比与蒸馏水混匀，充分溶解后，在125℃下灭菌5min，冷却至室温，即得所需浓度的无菌脱脂乳蔗糖培养基。种子发酵菌种的制备：将保藏编号为GCMCCNo.6431的柠檬明串珠菌LeuconostoccitreumBD01707的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于含2％wv蔗糖的M17琼脂培养基MerckCo.德国上，28℃好氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入20mL含2％wv蔗糖的M17液体培养基购买自MerckCo.德国，28℃180rpm摇床培养24h取出，培养物9,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。发酵乳中多糖果聚糖levan的制备：取发酵乳以15,000g离心10min，取上清液，加入3倍体积于上清液体积的无水乙醇，静置过夜，15,000g离心10min，收集沉淀物并溶于水后，真空冷冻干燥即得。发酵乳饮料中多糖果聚糖levan的制备：取发酵乳饮料15,000g离心10min，取上清液去除灭活的死菌体，加入3倍体积的无水乙醇，静置过夜，15,000g离心10min，收集沉淀物并溶于水后，真空冷冻干燥即得。2、富含果聚糖levan的发酵乳饮料的制备1将所得的柠檬明串珠菌BD01707种子以接种量2％vv无菌接种于含蔗糖15％vv、脱脂乳10％ww的培养基，30℃、200rpm培养96小时，发酵结束后取发酵乳，经测定，该发酵乳中levan含量为1.6％wv。2将白砂糖、柠檬酸完全溶解于50℃的水中，即得勾兑液。将上述发酵乳与勾兑液以1：2.02vv充分混合均匀后在15MP压力下进行均质，并于95℃灭菌20min，灌装，得本实施例的发酵乳饮料产品A。经检测，本实施例生产的富含果聚糖levan的发酵乳饮料中levan含量0.53％wv，甜度为含有10％的蔗糖甜度，酸度80°T。3、成分检测1柠檬明串珠菌BD01707发酵乳中多糖的单糖组成测定a标准样品配置：多糖水解：吸取100μL浓度为4mgmL～5mgmL的多糖样品溶液于5mL的具塞刻度试管中，加入100μL的4moLLTFA，充N2封管，110℃烘箱中水解2h；冷却后打开盖，加200μL甲醇后用N2吹干，如此重复加甲醇并用N2吹3次，去除TFA，将其残渣用水溶解定容至5mL，用0.45μm微孔膜过滤后供进样分析。b色谱条件色谱柱：CarboPacPA203mmi.d.×150mm；流动相：A、H2O；B、250mmolLNaOH；C、1molLNaAc；三元梯度洗脱：流速：0.5mLmin；积分脉冲安培检测器；Au工作电极：AgAgCl参比电极；进样体积：20μL；柱温：30℃。c按前述方法制备的步骤1发酵乳中的多糖样品，并以高效阴离子色谱法测定多糖的单糖组成。数据结果：柠檬明串珠菌BD01707多糖样品糖基组成的色谱分析结果见图1，该多糖在14.50min有单一吸收峰，且该吸收峰的保留时间与果糖标品保留时间一致。结论：柠檬明串珠菌BD01707多糖由果糖单一糖基组成，是一种果聚糖。2柠檬明串珠菌BD01707发酵乳中多糖的结构判定a傅里叶红外光谱FTIR测定将前述方法制备的步骤1发酵乳中的多糖样品与溴化钾粉末充分混合后，压制成片状，应用傅里叶红外光谱仪Nicolet6700,ThermoFisher公司，美国进行傅里叶红外光谱FTIR测定。结果如图2所示，3306cm-1处的强宽峰为分子间及分子内羟基吸收峰，2930cm-1和2884cm-1为果糖残基中C－H键伸缩振动的吸收峰，1634cm-1处的吸收峰是结合水所致，1412－1217cm-1为C－H变角振动的吸收峰，1120－1008cm-1处的吸收峰是C－O－C和C－O－H的伸缩振动的结果。923cm-1和810cm-1处的吸收峰与呋喃环的伸缩振动有关。结论：BD01707多糖的糖环构型以呋喃环为主。b核磁共振NMR测定将前述方法制备的步骤1发酵乳中的多糖样品按10mgmL的浓度完全溶解于重水中，并应用核磁共振波谱仪AvanceIII400MHz,Bruker公司，德国进行核磁共振NMR测定。结果如图3所示，图3中，A为NMR-1H谱，显示样品的七个质子的化学位移集中在3.4－4.2ppm区域，而图3中，B为NMR-13C谱，显示样品在104.537C-2,80.622C-5,76.628C-3,75.532C-4,63.716C-6和60.234C-1ppm处有共振。结论：FTIR与1H、13C谱的数据结合分析表明，BD01707多糖为果聚糖levan。实施例2富含果聚糖levan的发酵乳饮料的制备1、材料与方法脱脂乳蔗糖培养基的制备：将质量百分比为12％的脱脂乳粉与质量百分比为20％的蔗糖与蒸馏水混匀，充分溶解后，在95℃下灭菌20min，冷却至室温，即得所需浓度的无菌脱脂乳蔗糖培养基。种子发酵菌种的制备、发酵乳中多糖果聚糖levan的制备、发酵乳饮料中多糖果聚糖levan的制备：同实施例1。2、富含果聚糖levan的发酵乳饮料的制备1将所得的柠檬明串珠菌BD01707种子以接种量的体积百分比为0.5％无菌接种于含蔗糖20％、脱脂乳12％的培养基，35℃、100rpm培养120小时，发酵结束后取发酵乳，经测定该发酵乳中levan含量为1.44％，所述百分比为质量百分比。2将糖浆、阿斯巴甜、苹果酸、酒石酸、乳酸完全溶解于50℃的水中，即得勾兑液。将上述发酵乳与勾兑液以1：1.77vv充分混合均匀后在30MP压力下进行均质，并于125℃灭菌5min，灌装，得本实施例的发酵乳饮料产品B。经检测，本实施例生产的富含果聚糖levan的发酵乳饮料中levan含量0.52％，甜度为含有5％的蔗糖甜度，酸度70°T，所述百分比为质量百分比。实施例3富含果聚糖levan的发酵乳饮料的制备1、材料与方法脱脂乳蔗糖培养基的制备：将质量百分比为6％的脱脂乳粉与质量百分比为5％的蔗糖与蒸馏水混匀，充分溶解后，在100℃下灭菌15min，冷却至室温，即得所需浓度的无菌脱脂乳蔗糖培养基。种子发酵菌种的制备、发酵乳中多糖果聚糖levan的制备、发酵乳饮料中多糖果聚糖levan的制备：同实施例1。2、富含果聚糖levan的发酵乳饮料的制备1将所得的柠檬明串珠菌BD01707种子以接种量4.0％vv无菌接种于蔗糖质量百分比含量为5％、脱脂乳质量百分比含量为6％的培养基，20℃、300rpm培养48小时，发酵结束后取发酵乳，经测定，该发酵乳中levan的质量百分比含量为0.86％。2将白砂糖、甜蜜素、安赛密、柠檬酸、醋酸完全溶解于50℃的水中，即得勾兑液。将上述发酵乳与勾兑液以1：0.69vv充分混合均匀后在25MP压力下进行均质，并于120℃灭菌10min，灌装，得本实施例的发酵乳饮料产品C。经检测，本实施例生产的富含果聚糖levan的发酵乳饮料中levan的质量百分比含量为0.51％，甜度为含有6.8％的蔗糖甜度，酸度73°T。实施例4富含果聚糖levan的发酵乳饮料的制备1、材料与方法脱脂乳蔗糖培养基的制备：将质量百分比为8％的脱脂乳粉与质量百分比为10％的蔗糖按一定配比与蒸馏水混匀，充分溶解后，在120℃下灭菌10min，冷却至室温，即得所需浓度的无菌脱脂乳蔗糖培养基。种子发酵菌种的制备、发酵乳中多糖果聚糖levan的制备、发酵乳饮料中多糖果聚糖levan的制备：同实施例1。2、富含果聚糖levan的发酵乳饮料的制备1将所得的柠檬明串珠菌BD01707种子以接种量1.0％vv无菌接种于含蔗糖质量百分比含量为10％、脱脂乳质量百分比含量为8％的培养基，25℃、150rpm培养72小时，发酵结束后取发酵乳，经测定，该发酵乳中levan含量为1.26％wv。2将白砂糖、糖浆、安赛密、柠檬酸、乳酸、醋酸完全溶解于50℃的水中，即得勾兑液。将上述发酵乳与勾兑液以1：1.33vv充分混合均匀后在20MP压力下进行均质，并于100℃灭菌15min，灌装，得本实施例的发酵乳饮料产品D。经检测，本实施例生产的富含果聚糖levan的发酵乳饮料中levan的质量百分比含量为0.54％，甜度为含有8.5％的蔗糖甜度，酸度77°T。实施例5富含果聚糖levan的发酵乳饮料的制备1、材料与方法脱脂乳蔗糖培养基的制备：将质量百分比含量为8％脱脂乳粉与质量百分比含量为12％的蔗糖与蒸馏水混匀，充分溶解后，在115℃下灭菌12min，冷却至室温，即得所需浓度的无菌脱脂乳蔗糖培养基。种子发酵菌种的制备、发酵乳中多糖果聚糖levan的制备、发酵乳饮料中多糖果聚糖levan的制备：同实施例1。2、富含果聚糖levan的发酵乳饮料的制备1将所得的柠檬明串珠菌BD01707种子以接种量3.0％vv无菌接种于含蔗糖质量百分比含量为12％、脱脂乳质量百分比含量为8％的培养基，28℃、250rpm培养88小时，发酵结束后取发酵乳，经测定，该发酵乳中levan的质量百分比含量为1.48％。2将白砂糖、糖浆、阿斯巴甜、甜蜜素、安赛密、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、醋酸完全溶解于50℃的水中，即得勾兑液。将上述发酵乳与勾兑液以1：1.69vv充分混合均匀后在22MP压力下进行均质，并于115℃灭菌12min，灌装，得本实施例的发酵乳饮料产品E。经检测，本实施例生产的富含果聚糖levan的发酵乳饮料中levan的质量百分比含量为0.55％，甜度为含有7.6％的蔗糖甜度，酸度75°T。实施例6富含果聚糖levan的发酵乳饮料的制备1、材料与方法脱脂乳蔗糖培养基的制备：将质量百分比含量为8％脱脂乳粉与质量百分比含量为12％的蔗糖与蒸馏水混匀，充分溶解后，在125℃下灭菌5min，冷却至室温，即得所需浓度的无菌脱脂乳蔗糖培养基。种子发酵菌种的制备、发酵乳中多糖果聚糖levan的制备、发酵乳饮料中多糖果聚糖levan的制备：同实施例1。2、富含果聚糖levan的发酵乳饮料的制备1将所得的柠檬明串珠菌BD01707种子以接种量3.0％vv无菌接种于含蔗糖质量百分比含量为12％、脱脂乳质量百分比含量为8％的培养基，28℃、250rpm培养88小时，发酵结束后取发酵乳，经测定，该发酵乳中levan的质量百分比含量为1.35％。2将白砂糖、糖浆、阿斯巴甜、甜蜜素、安赛密、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、醋酸完全溶解于50℃的水中，即得勾兑液。将上述发酵乳与勾兑液以1：1.41vv充分混合均匀后在15MP压力下进行均质，并于95℃灭菌20min，灌装，得本实施例的发酵乳饮料产品F。经检测，本实施例生产的富含果聚糖levan的发酵乳饮料中levan的质量百分比含量为0.56％，甜度为含有9.1％的蔗糖甜度，酸度71°T。对比例1将实施例1中的接种量，培养温度，发酵时间，发酵震荡的速度以及蔗糖浓度逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的发酵乳液，各组所得发酵乳液中levan的含量如表1所示。表1不同方法制备所得发酵乳液中levan的含量从表1所示的结果中可以得出，将所述脱脂乳发酵液的制备方法中接种量，培养温度，发酵时间，发酵震荡的速度以及蔗糖浓度调整到本发明之外的时候，所得发酵乳液中果聚糖levan的含量会显著降低。效果实施例1所得发酵乳饮料产品口味与喜好程度测试以上述实施例所制备的发酵乳饮料产品A、B、C、D和E为实验对象，进行产品的口味测试。测试人数50人。品尝方式：采用不记名打分的方式进行品尝；分别对上述发酵乳饮料产品A、B、C、D和E的色泽、酸甜比、风味、口感、营养项进行单独打分，每一项满分是20分，计算平均分及其总分，统计结果记录于表2。同时，根据对产品的整体喜好程度给出的意见，统计对每个单品的喜好人数，统计结果记录于表3。表2发酵乳饮料产品口味测试结果数据统计表表3产品喜好程度测试结果数据统计表从产品口味测试和喜好程度统计结果可以看出，总体而言，本发明的富含果聚糖levan的发酵乳饮料在产品风味、口感、营养方面可被大部分消费者所接受。效果实施例2产品中果聚糖levan的稳定性实验以上述实施例制备所得的发酵乳饮料产品A、B、C、D和E为实验对象，在常温条件下放置，根据实施例1中所述方法测定不同放置时间内产品中的果聚糖levan含量，结果见表4。表4产品中果聚糖levan含量的变化由上表结果可以看出，本发明的发酵乳饮料在常温保存90天期间内，其中的果聚糖levan未发生降解，含量稳定不变。应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

权利要求：1.一株柠檬明串珠菌Leuconostoccitreum的菌株，其特征在于，所述菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNO.6431。2.一种柠檬明串珠菌的发酵方法，其特征在于，所述发酵方法包括以下步骤：将权利要求1中保藏编号为CGMCCNO.6431的所述柠檬明串珠菌的菌株在脱脂乳蔗糖培养基中发酵培养即得。3.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，所述菌株的接种量为0.5％～4.0％，所述百分比为体积百分比。4.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，所述脱脂乳蔗糖培养基的制备方法包括以下步骤：将脱脂乳粉和蔗糖与水混匀溶解，95～125℃灭菌5～20分钟，冷却即得；所述脱脂乳蔗糖培养基中所述脱脂乳粉的含量为6～12％，所述蔗糖的含量为5～20％，所述百分比为质量百分比。5.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养为震荡发酵培养，所述发酵培养的温度为20℃～35℃，所述震荡发酵培养的震荡速度为100～300rpm，所述发酵培养的时间为48～120小时。6.如权利要求1所述的菌株在制备富含果聚糖levan的发酵乳饮料中的应用。

百度查询： 光明乳业股份有限公司 一种富含果聚糖levan的发酵乳饮料及其制备方法