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申请/专利权人：山东理工大学

摘要：本发明适用于生物技术领域，提供了一种促进B.subtilis内血红素生物合成的方法，以实验室已构建的产血红素的B.subtilisBSH6为出发菌，首先对尿卟啉原Ⅲ合成途径进行工程改造；即整合表达hemCDB操纵子，考察其对菌株生长和血红素合成的影响；然后对血红素下游合成途径进行改造，即整合表达异源的血红素分泌蛋白基因ccmABC、敲除尿卟啉原Ⅲ甲基转移酶基因nasF、血红素单加氧酶基因hmoA和hmoB，考察其对菌株生长和血红素合成的影响；最后分别以蔗糖和葡萄糖为碳源进行分批补料发酵，提高血红素的发酵水平。本发明为将来工业上通过合成生物学手段构建高效合成血红素的枯草芽孢杆菌细胞工厂和血红素的高密度发酵提供了基础研究和理论依据。

主权项：1.一种促进B.subtilis内血红素生物合成的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、整合表达hemCDB：获得PlapS-hemCDB在gcvTP位点整合表达的重组菌株BSH7；S2、摇瓶发酵培养及菌体生长情况的测定：培养并发酵活化的单菌落并测定发酵液去上清后的菌悬液的OD600值；S3、实时定量反转录PCR分析：取步骤S2中的发酵液，收集菌体，处理后并计算获得待测基因hemA、hemD、hemH、hemQ的相对表达量；S4、血红素的荧光检测：取步骤S2中的发酵液，处理并计算获得血红素的总合成量；S5、整合表达异源ccmABC：在B.subtilis基因组上的ywjI位点整合表达E.coli的ccmABC；获得PlapS-ccmABC在ywjI位点整合表达的重组菌株BSH8；S6、敲除nasF：基于重组菌株BSH8获得nasF敲除菌株BSH9；S7、敲除hmoA：基于菌株BSH9获得hmoA敲除菌株BSH10；S8、敲除hmoB：基于菌株BSH10获得hmoB敲除菌株BSH11；S8、分批补料发酵：从平板上挑取新活化的单菌落接入装有5mLLB液体培养基的试管中，37℃、200rmin振荡培养12h；按1％接种量转接至装有100mL发酵培养基的500mL锥形瓶中，37℃、200rmin振荡培养12h；按10％接种量转接至装有900mL发酵培养基的2L发酵罐中，发酵温度为37℃，初始通气量为3Lmin，初始转速300rpm，开始关联转速与溶氧，溶氧控制在40％；当转速升到1000rpm以后，固定转速，关联通气、补料与溶氧，使溶氧控制在40％，整个发酵工程中用1molL的NaOH控制pH维持在7.0附近；生物量的测定：分别于发酵4h、8h、12h、24h、28h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h、168h取1mL发酵液，离心去上清，用水将细胞沉淀洗涤后重悬、稀释适当倍数，测定菌悬液的OD600值；S9、血红素的HPLC检测：每间隔24h取样2mL，12000rpm离心5min，上清液稀释适当倍数后进行HPLC检测，用于测定胞外血红素含量；细胞沉淀用10mL1molLNaoH溶解并振荡混匀，超声破碎10min，用HCl将pH调节至7.0左右后，离心取上清进行HPLC检测，用于测定胞内血红素含量。

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