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申请/专利权人：中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)

摘要：本发明提供了一种新型HBB过表达载体及其设计方法和应用，所述HBB过表达载体包括HBB表达模块；所述HBB表达模块包括串联放置的DNaseI核心高敏位点、启动子、HBB表达框和下游高敏位点；所述DNaseI高敏位点包括串联表达的HS4、HS3、HS2和3’E等；所述HBB表达模块的总长度小于4kb。本发明通过精简和优化顺式作用元件和HBB表达框，不仅显著缩短了HBB表达模块的长度，而且提高了HBB表达模块的转录激活强度，实现了HBB珠蛋白基因的高效稳定特异性激活。

主权项：1.一种HBB过表达载体，其特征在于，包括HBB表达模块；所述HBB表达模块包括依次串联放置的DNaseI高敏位点、突变型HBG启动子、HBB表达框和增强子；所述DNaseI高敏位点包括依次串联表达的HS4、HS3和HS2；所述HBB表达模块的长度小于4kb；所述HS2的核苷酸序列上包含TAL1、GATA1、KLF1、NFE2、GR和SOX6反式因子的结合基序；所述HS2的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述HS3的核苷酸序列上包含GATA1、SOX6、TAL1、STAT5、NFE2和KLF1反式因子的结合基序；所述HS3的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；所述HS4的核苷酸序列上包含SOX6、TAL1、NFE2、GATA1、GFI1B和KLF1反式因子的结合基序；所述HS4的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；所述突变型HBG启动子的核苷酸序列上包含GATA1、TAL1和TBP反式因子的结合基序；所述突变型HBG启动子的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示；所述HBB表达框的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；所述增强子的核苷酸序列上包含SOX6、GATA1、KLF1、SPI1B、TAL1和GFI1B反式因子的结合基序；所述增强子的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示。

全文数据：一种新型HBB过表达载体及其设计方法和应用技术领域本发明属于生物技术领域，涉及一种载体及其设计方法和应用，尤其涉及一种新型HBB过表达载体及其设计方法和应用。背景技术β-地中海贫血是由于β-珠蛋白基因座HBB，β-globin发生碱基替代、缺失、删除、倒位等基因突变，造成β-珠蛋白肽链生成障碍或异常，引发合成不足或完全缺乏，使得血红蛋白α、β两种亚基比例失衡，患者不能形成功能性血红蛋白，同时导致溶血性贫血，使机体氧气供应严重不足，重者危及生命。在我国，地中海贫血已成为长江以南各省发病率最高、影响最大的遗传病之一。我国南方地区的地中海贫血基因缺陷率为2.5％～20％，其中广东省地中海贫血基因缺陷发生率高达10％，每9个人就有1人携带地中海贫血基因，携带率高达8.5％，全省地中海贫血的病例数占全国总数的15，每年平均新增4000例地贫。基因治疗被认为是下一代临床治疗的终极手段。基因治疗GeneTherapy是指将外源DNA片段导入靶细胞，以纠正、修复、替换、补偿或沉默等方式对缺陷和异常基因进行针对性干预，以期恢复正常的基因功能，最终达到治疗甚至完全治愈的目的。目前国际上通过慢病毒载体过表达HBB成人β-globin的策略开展β-地中海贫血的基因治疗已经进入临床III期试验，即将进入上市前准备。慢病毒是来源于人类免疫缺陷病毒-1HIV-1的一种转基因载体，不需要经历细胞分裂和细胞核膜破裂过程，就可以进入细胞核，将RNA基因组反转录后整合到宿主基因组上，对分裂细胞和非分裂细胞都具有感染能力，从而使得向造血干细胞HSC中进行基因转导的效率大幅度提高。利用慢病毒技术治疗地中海贫血策略为1分离和纯化地中海贫血患者的造血干细胞；2构建并包装过表达HBB的慢病毒颗粒；3HBB慢病毒体外感染造血干细胞；4自体造血干细胞移植。目前国际同行已经开发出多种β-地中海贫血基因治疗载体，如HPV56、BB305、GLOBE等，主要构建策略为根据β-珠蛋白基因簇的调控元件特征，将相关核心顺式元件与HBB基因表达框串联，组装成精简的HBB表达模块，反向装载到慢病毒载体上；慢病毒转导HSC后，其装载的表达模块将随机插入整合至HSC基因组中；在HSC向红系分化过程中，红系特异转录因子将识别并结合逐渐开放的顺式元件及HBB启动子区域，激活外源性HBB基因的强力表达。如图1所示为BB305载体，作为最成功的一种HBB慢病毒载体，已广泛应用于临床试验中。当前国际上有多项相关临床试验正在进行。其中，美国蓝鸟公司BlueBird以BB305载体为骨架生产的慢病毒药物LentiGlobin的II期或III期临床试验结果振奋人心。2017年，BB305载体首次用于治疗镰刀型贫血症，结果发现，基因转导的HSC在分化为红细胞后，血红蛋白的异常聚集明显降低，疗效显著。2018年，NEJM再次报道了该团队的II期临床试验结果HGB-204和HGB-205：22位输血依赖的地贫患者，通过LentiGlobin基因治疗后，在长达3年的观测中，有15位不再需要进行输血治疗，其余还需输血的患者其输血量和输血次数也大大降低。在最近的第60届美国血液学年会ASH上，蓝鸟公司公布了最新的III期临床结果HGB-207和HGB-212，在11位患者中有10位不再需要输血治疗。如图2所示，在β样珠蛋白基因簇β-likeglobingenecluster上游存在若干关键性顺式调控元件，组成基因座控制区LCR，这些顺式元件在红系细胞中高度开放，对DNaseI高度敏感，因此被命名为DNaseI高敏位点，包括HS1、HS2、HS3、HS4和HS5。这些高敏位点与红系分化相关反式因子特异性结合，精密高效地调控珠蛋白基因在发育及分化水平的差异表达。其中，HS1的增强子活性较弱；HS2、HS3和HS4是关键的红系高敏位点，是最主要的顺式元件，起到促进HBB表达的“超级增强子”功能；HS5主要起“隔离子”功能；同样，在β-globin下游存在一个3’E元件，对β-globin表达具有重要的正向调控功能；此外，在基因簇下游20kb左右还有一个3’HS1，该位点可与HS5形成loop成环结构，使得β-likeglobingenecluster处于相对开放又封闭的染色质结构中，促进珠蛋白基因的高效特异激活表达。现有的LentiGlobin的HBB表达框为4.8kb，长度较大，慢病毒包装滴度较低，因此亟需进一步精简优化HBB珠蛋白基因表达模块，从而提高慢病毒包装滴度，提高表达稳定性及强度。发明内容针对现有技术的不足，本发明提供了一种新型HBB过表达慢病毒载体及其设计方法和应用，通过凝练珠蛋白基因顺式调控区域，优化顺式调控元件及表达框，实现HBB珠蛋白基因长期高效稳定的特异性激活，将创新的HBB珠蛋白基因表达模块组装进慢病毒或腺相关病毒载体中，在地中海贫血的基因治疗方面具有重要应用价值。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种HBB过表达载体，包括HBB表达模块；所述HBB表达模块包括串联放置的DNaseI高敏位点、启动子、HBB表达框和增强子；所述DNaseI高敏位点包括串联表达的HS4、HS3和HS2；所述HBB表达模块的长度小于4kb。本发明系统挖掘已报道的ChIP-seq数据，解析反式作用因子的结合基序Consensusmotif，精准定位核心的调控基序并对其进行了精简、优化，凝炼整合和改造得到精简的HBB表达模块，构建了新型HBB过表达载体，长度缩短至3.7kb。本发明中，HS2、HS3和HS4是3个关键的红系高敏位点，相当于促进HBB表达的超级增强子。优选地，所述HS2的核苷酸序列上包括但不限于内源性的TAL1、GATA1、KLF1、NFE2、GR和SOX6的结合基序。本发明中，TAL1、GATA1、KLF1、NFE2、GR和SOX6等转录因子均为红系细胞特异性的反式作用因子。优选地，所述HS2的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；SEQIDNO:1所示的核苷酸序列为：caggtgcttcaaaaccatttgctgaatgattactatactttttacaagctcagctccctctatcccttccagcatcctcatctctgattaaataagcttcagtttttccttagttcctgttacatttctgtgtgtctccattagtgacctcccatagtccaagcatgagcagttctggccaggcccctgtcggggtcagtgccccacccccgccttctggttctgtgtaaccttctaagcaaaccttctggctcaagcacagcaatgctgagtcatgatgagtcatgctgaggcttagggtgtgtgcccagatgttctcagcctagagtgatgactcctatctgggtccccagcaggatgcttacagggcagatggcaaaaaaaaggagaagctgaccacctgactaaaactccacctcaaacggcatcataaagaaaatggatgcctgagacagaatgtgacatattctagaatatattatttcctgaatatatatatatatatacacatatacgtatatatatatatatatatatatttgttgttatcaattgccatagaatgattagttattgtgaatcaaatatttatcttgcaggtg.根据本发明，与BB305载体中的HS2相比，本发明的HS2的核苷酸序列的长度虽然保持0.6kb不变，但前后截取位置有所变化，通过引入关键的反式作用因子结合基序，显著增强的了HS2的增强子活性。优选地，所述HS3的核苷酸序列上包括但不限于内源性的GATA1、SOX6、TAL1、STAT5、NFE2和KLF1等的结合基序。本发明中，GATA1、SOX6、TAL1、STAT5、NFE2和KLF1均为红系细胞特异性的反式作用因子。优选地，所述HS3的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；SEQIDNO:2所示的核苷酸序列为：tatctttattttgccatgacaagactgagctcagaagagtcaagcatttgcctaaggtcggacatgtcagaggcagtgccagacctatgtgagactctgcagctactgctcatgggccctgtgctgcactgatgaggaggatcagatggatggggcaatgaagcaaaggaatcattctgtggataaaggagacagccatgaagaagtctatgactgtaaatttgggagcaggagtctctaaggacttggatttcaaggaattttgactcagcaaacacaagaccctcacggtgactttgcgagctggtgtgccagatgtgtctatcagaggttccagggagggtggggtggggtcagggctggccaccagctatcagggcccagatgggttataggctggcaggctcagataggtggttaggtcaggttggtggtgctgggtggagtccatgactcccaggagccaggagagatagaccatgagtagagggcagacatgggaaaggtgggggaggcacagcatagcagcatttttcattctactactacatgggactgctcccctatacccccagctaggggcaagtg.根据本发明，与BB305载体中的HS3相比，本发明的HS3的核苷酸序列由0.8kb精简为0.6kb。优选地，所述HS4的核苷酸序列上包括但不限于内源性的SOX6、TAL1、NFE2、GATA1、GFI1B和KLF1等的结合基序。本发明中，SOX6、TAL1、NFE2、GATA1、GFI1B和KLF1均为红系细胞特异性的反式作用因子。优选地，所述HS4的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；SEQIDNO:3所示的核苷酸序列为：acaaagacaagcacgtggacctgggaggagggttattgtccatgactggtgtgtggagacaaatgcaggtttataatagatgggatggcatctagcgcaatgactttgccatcacttttagagagctcttggggaccccagtacacaagaggggacgcagggtatatgtagacatctcattctttttcttagtgtgagaataagaatagccatgacctgagtttatagacaatgagcccttttctctctcccactcagcagctatgagatggcttgccctgcctctctactaggctgactcactccaaggcccagcaatgggcagggctctgtcagggctttgatagcactatctgcagagccagggccgagaaggggtggactccagagactctccctcccattcccgagcagggtttgcttatttatgcatttaaatgatatatttattttaaaagaaataacaggagactgcccagccctggctgtgacatggaaactatgtagaatattttgggttccatttttttttccttctttcagttagaggaaaaggggctcactgcacatacactagacagaaagtcaggagctttgaatccaagcctgatcatttccatgtcatactgagaaagtccccacccttctctgagcctcagtttctctttttataagtaggagtctggagtaaatgatttccaatggctctcatttcaatacaa.根据本发明，与BB305载体中的HS4相比，本发明的HS4的核苷酸序列由1.2kb精简为0.7kb。优选地，所述启动子包括HBB启动子或突变型HBG启动子。优选地，所述HBB启动子的核苷酸序列上包括但不限于内源性的TAL1、GATA1、KLF1和TBP的结合基序。本发明中，TAL1、GATA1和KLF1为红系细胞特异性的反式作用因子。优选地，所述HBB启动子的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；SEQIDNO:4所示的核苷酸序列为：aagctgtgattccaaatattacgtaaatacacttgcaaaggaggatgtttttagtagcaatttgtactgatggtatggggccaagagatatatcttagagggagggctgagggtttgaagtccaactcctaagccagtgccagaagagccaaggacaggtacggctgtcatcacttagacctcaccctgtggagccacaccctagggttggccaatctactcccaggagcagggagggcaggagccagggctgggcataaaagtcagggcagagccatctattgctt.根据本发明，对ENCODE数据库中的ChIP-seq结果进行分析，启动子的前0.29kb富集多种反式作用因子的结合基序，为最核心的转录起始元件，本发明截取前0.29kb作为HBB启动子。优选地，所述突变型HBG启动子的核苷酸序列上包括但不限于内源性的GATA1、TAL1和TBP等的结合基序。本发明中，GATA1和TAL1为红系细胞特异性的反式作用因子。优选地，所述突变型HBG启动子的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示；SEQIDNO:5所示的核苷酸序列为：gctaaagggaagaataaattagagaaaaattggaatgactgaatcggaacaaggcaaaggctataaaaaaaattaagcagcagtatcctcttgggggcgcctcccgcacactatctcaatgcaaacatctgtctgaaacggtccctggctaaactccacccatgggttggccagccttgccttaactgatagccttgacaaggcaaacttgaccaatagtcttagagtatccagtgaggccaggggccggcggctggctagggatgaagaataaaaggaagcacccttcagcagttccac.根据本发明，参考HPFH基因特征，对HBG启动子进行多个位点的联合突变，本发明设计开发创新的0.3kb突变型HBG启动子，经突变优化后ZBTB7A和BCL11A不再与突变型HBG启动子结合，消除了ZBTB7A和BCL11A的沉默阻遏作用，突变型HBG启动子具有近乎100％的激活活性，可以有效驱动HBB基因的表达。优选地，所述HBB表达框的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；SEQIDNO:6所示的核苷酸序列为：acatttgcttctgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacaccatggtgcatctgactcctgaggagaagtctgccgttactgccctgtggggcaaggtgaacgtggatgaagttggtggtgaggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccacccttaggctgctggtggtctacccttggacccagaggttctttgagtcctttggggatctgtccactcctgatgctgttatgggcaaccctaaggtgaaggctcatggcaagaaagtgctcggtgcctttagtgatggcctggctcacctggacaacctcaagggcacctttgccacactgagtgagctgcactgtgacaagctgcacgtggatcctgagaacttcagggtgagtctatgggacgcttgatgttttctttccccttcttttctatggttaagttcatgtcataggaaggggataagtaacagggtacagtttagaatgggaaacagacgaatgattgcatcagtgtggaagtctcaggatcgttttagtttcttttatttgctgttcataacaattgttttcttttgtttaattcttgctgatacaatgtatcatgcctctttgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaaggcaatagcaatatctctgcatataaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcagctacaatccagctaccattctgcttttattttatggttgggataaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacagctcctgggcaacgtgctggtctgtgtgctggcccatcactttggcaaagaattcaccccaccagtgcaggctgcctatcagaaagtggtggctggtgtggctaatgccctggcccacaagtatcactaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgc.根据本发明，在UCSC数据库中定位HBB基因座，对HBB表达框进行分析：1号内含子中富集有大量顺式作用元件的结合基序且长度较短，不进行调整；2号内含子的中间部分几乎没有重要的反式作用因子的结合基序，但是存在抑制转录的MIER1的结合基序，因此在2号内含子内删除了387bp的MIER1结合区域，精简了HBB表达框的长度。优选地，所述增强子的核苷酸序列上包括但不限于内源性的SOX6、GATA1、KLF1、SPI1B、TAL1和GFI1B的结合基序。本发明中，SOX6、GATA1、KLF1、TAL1和GFI1B为红系细胞特异性的反式作用因子，SPI1B为髓系反式因子。优选地，所述增强子的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示；SEQIDNO:7所示的核苷酸序列为：tgtagcttgatattcactactgtcttattaccctgtcataggcccaccccaaatggaagtcccattcttcctcaggatgtttaagattagcattcaggaagagatcagaggtctgctggctcccttatcatgtcccttatggtgcttctggctctgcagttattagcatagtgttaccatcaaccaccttaacttcatttttcttattcaatacctaggtaggtagatgctagattctggaaataaaatatgagtctcaagtggtccttgtcctctctcccagtcaaattctgaatctagttggcaagattctgaaatcaaggcatataatcagtaataagtgatgata.第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的HBB过表达载体的设计方法，所述方法包括对DNaseI高敏位点、启动子、HBB表达框和增强子进行精简的步骤。优选地，所述DNaseI高敏位点包括串联放置的HS4、HS3和HS2。优选地，所述启动子包括HBB启动子或突变型HBG启动子。优选地，所述HBB启动子的设计方法包括对HBB启动子的转录起始元件进行截取的步骤。本发明中，对ENCODE数据库中ChIP-seq结果进行分析，启动子的前0.29kb富集多种反式作用因子的结合基序，为最核心的转录起始元件，因此截取前0.29kb作为HBB启动子。优选地，所述突变型HBG启动子的设计方法包括对野生型HBG启动子的第-202至-113位核苷酸进行取代突变的步骤。优选地，所述取代包括第-202位、第-198位、第-195位、第-175位、第-117位、第-114位和第-113位的核苷酸被取代。优选地，所述突变位点包括-202CG、-198TC、-195CG、-175TC、-117GA、-114CT和-113AG。根据本发明，通过对HBG启动子在-202CG、-198TC、-195CG、-175TC、-117GA、-114CT和-113AG的7个位点进行联合突变，使得突变后的HBG启动子不再与ZBTB7A和BCL11A结合，消除了ZBTB7A和BCL11A对HBG启动子的沉默阻遏作用。优选地，所述HBB表达框的设计方法包括对HBB表达框的2号内含子进行精简的步骤。优选地，所述精简为删除2号内含子中的MIER1结合区域。第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的HBB过表达载体的制备方法，所述方法包括以下步骤：1将如SEQIDNO:1-7所述的核苷酸序列通过酶切连接和同源重组的方式组装成完整的HBB表达模块；2将步骤1得到的HBB表达模块装载进入载体，得到所述HBB过表达载体；优选地，步骤2所述载体包括慢病毒载体或腺相关病毒载体。第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的HBB过表达载体在制备地中海贫血治疗药物中的应用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1本发明通过精简和优化顺式作用元件和HBB表达框，使得HBB表达模块的长度缩短至4kb以下，有利于将HBB表达模块有效装载入慢病毒载体或腺相关病毒载体中，显著提高了慢病毒包装滴度，便于同源重组Donor模板的组装；2本发明通过向优化的顺式作用元件中引入关键的反式作用因子结合基序，增强了高敏位点的增强子活性，提高了HBB表达模块的转录激活强度；3本发明根据HPFH疾病的基因突变特征，对野生型HBG启动子进行突变，消除了ZBTB7A和BCL11A的沉默阻遏作用，突变型HBG启动子具有近乎100％的激活活性，可以有效驱动HBB基因的表达，同时将HS2、HS3和HS4与mutHBGpro串联，实现了HBB珠蛋白基因的高效稳定特异性激活；4本发明通过优化HBB珠蛋白基因的表达框，删除2号内含子中抑制转录的MIER1的结合区域，增强了转录后翻译效率，实现过表达HbA蛋白的可鉴别性检测。附图说明图1为现有美国BlueBird公司的BB305HBB表达载体，其中，E：3’增强子，β-p：HBB基因启动子，HS2、HS3和HS4：3个关键的红系高敏位点；图2为β样珠蛋白基因簇基因座上下游的若干关键性的顺式调控元件；图3A为优化的HS2序列特征，图3B为优化的HS3序列特征，图3C为优化的HS4序列特征，图3D为优化的HBB启动子序列特征，图3E为优化的突变型HBG启动子序列特征，图3F为优化的HBB表达框，图3G为优化的增强子序列特征；图4为2号内含子中对转录具有负面作用的MIER1结合区域的位置；图5A为采用HBB启动子驱动表达的HBB过表达载体，图5B为采用突变型HBG启动子驱动表达的HBB过表达载体；图6A为利用HBB过表达载体包装慢病毒，感染HUDEP-2细胞，表达GFP的阳性率结果，图6B为同等条件下，Bluebird公司BB305载体表达GFP的阳性率结果，图6C为阴性对照。图7为mutHBGpro比野生型HBGpro在HUDEP-2细胞中具有更高的转录激活活性。具体实施方式为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。实施例1HS2、HS3和HS4的优化本实施例系统挖掘已报道的ChIP-seq数据，解析反式作用因子的结合基序Consensusmotif，精准定位HS2、HS3和HS4的调控基序并进行了精简和优化，具体的优化特征为：1如图3A所示，HS2的长度保持0.6kb不变，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，方框为转录因子的保守结合基序，粗体为高度保守碱基，方框下方为相应的转录因子名称，精简后的HS2上含有TAL1、GATA1、KLF1、NFE2、GR和SOX6的结合基序；2如图3B所示，HS3的长度由BB305载体的0.8kb精简为0.6kb，核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，方框为转录因子的保守结合基序，粗体为高度保守碱基，方框下方为相应的转录因子名称，精简后的HS3上含有GATA1、SOX6、TAL1、STAT5、NFE2和KLF1的结合基序；3如图3C所示，HS4的长度由BB305载体的1.2kb精简为0.7kb，核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，方框为转录因子的保守结合基序，粗体为高度保守碱基，方框下方为相应的转录因子名称，精简后的HS4上含有SOX6、TAL1、NFE2、GATA1、GFI1B和KLF1的结合基序。实施例2启动子优化本实施例对HBB启动子进行重新分析，发现前0.29kb为最核心的转录起始元件，根据启动子区的反式作用因子的富集程度进行精简，提取前0.29bp序列，得到如图3D所示的HBB启动子，核苷酸序列如SEQIDNO:4所示，方框为转录因子的保守结合基序，粗体为高度保守碱基，方框下方为相应的转录因子名称，精简后的HBB启动子上含有TAL1、GATA1、KLF1和TBP的结合基序；本实施例进一步参考HPFH特征，对HBG启动子进行联合突变，突变位点如表1所示，得到的创新的0.3kb突变型HBG启动子如图3E所示，核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，方框为转录因子的保守结合基序，粗体为高度保守碱基，方框下方为相应的转录因子名称。突变型HBG启动子上含有GATA1、TAL1和TBP的结合基序，但ZBTB7A和BCL11A不再与HBG启动子结合，消除了ZBTB7A和BCL11A对HBG启动子的沉默阻遏作用。经过联合突变后，突变型HBG启动子具有近乎100％的激活活性，可以有效驱动HBB基因的表达。表1根据文献报道的HPFH突变信息进行突变整合突变位点-202CG-198TC-195CG-175TC-117GA-114CT-113AGHbF19-23％4-12％4-5％17-29％26-33％3-14％6.5％实施例3HBB表达框的优化本实施例在UCSC数据库中定位HBB基因座，对HBB表达框进行重新分析：1号内含子中富集有大量顺式作用元件的结合基序且长度较短，不进行调整；2号内含子的中间部分几乎没有重要的反式作用因子的结合基序，但是存在抑制转录的MIER1的结合基序，因此在2号内含子内删除了387bp的MIER1结合区域图4中的阴影区域，精简了HBB表达框的长度。如图3F所示，精简的HBB表达框的长度为1.2kb，核苷酸序列如SEQIDNO:6所示，大写斜体为5’-UTR和3’UTR，大写为ORF框，小写为内含子，小写加粗为内含子两端的保守序列，2号内含子中的大写为剪接分歧位点，2号内含子中的加粗斜体的“ct”中间删除了387bp。实施例4增强子的优化如图3G所示，3’增强子3’E的长度精简为0.35kb，核苷酸序列如SEQIDNO:7所示，方框为转录因子的保守结合基序，粗体为高度保守碱基，方框下方为相应的转录因子名称，精简后的3’E上含有SOX6、GATA1、KLF1、SPI1B、TAL1和GFI1B的结合基序。实施例5新型HBB过表达载体的组装根据实施例1-4得到的优化元件，从基因组中克隆得到如SEQIDNO:1-7所示的核苷酸序列，通过酶切连接和同源重组方式组装得到完整的HBB表达模块，全长约3.74kb，不超过4kb，反向装载入慢病毒载体中，构建得到如图5A和图5B所示的新型HBB过表达慢病毒载体。利用构建的新型HBB过表达慢病毒载体感染HUDEP-2细胞，检测HBB启动子HBBpro驱动GFP表达的阳性率，结果如图6A、图6B和图6C所示，构建的新型HBB过表达慢病毒载体具有良好的转录激活活性，毫不逊色美国Bluebird公司的BB305载体；如图7所示，突变型HBG启动子mutHBGpro比野生型HBG启动子HBGpro在HUDEP-2细胞中具有更高的转录激活活性。将构建的HBB表达模块反向装载入腺相关病毒表达载体中，构建得到的新型HBB过表达腺相关病毒载体具有与HBB过表达慢病毒载体相当的转录激活活性。综上所述，本发明通过精简和优化顺式作用元件和HBB表达框，使得HBB表达模块的长度缩短至4kb以下，有利于将HBB表达模块有效装载入慢病毒载体或腺相关病毒载体中，显著提高了慢病毒包装滴度，便于同源重组Donor模板的组装；本发明通过向优化的顺式作用元件中引入关键的反式作用因子结合基序，增强了高敏位点的增强子活性，对野生型HBG启动子进行突变，消除了ZBTB7A和BCL11A的沉默阻遏作用，同时删除2号内含子中抑制转录的MIER1的结合区域，提高了HBB表达模块的转录激活强度，实现了HBB珠蛋白基因的高效稳定特异性激活，在地中海贫血治疗中具有重要意义。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。SEQUENCELISTING中国医学科学院血液病医院（血液学研究所）一种新型HBB过表达载体及其设计方法和应用201905237PatentInversion3.31602DNA人工合成1caggtgcttcaaaaccatttgctgaatgattactatactttttacaagctcagctccctc60tatcccttccagcatcctcatctctgattaaataagcttcagtttttccttagttcctgt120tacatttctgtgtgtctccattagtgacctcccatagtccaagcatgagcagttctggcc180aggcccctgtcggggtcagtgccccacccccgccttctggttctgtgtaaccttctaagc240aaaccttctggctcaagcacagcaatgctgagtcatgatgagtcatgctgaggcttaggg300tgtgtgcccagatgttctcagcctagagtgatgactcctatctgggtccccagcaggatg360cttacagggcagatggcaaaaaaaaggagaagctgaccacctgactaaaactccacctca420aacggcatcataaagaaaatggatgcctgagacagaatgtgacatattctagaatatatt480atttcctgaatatatatatatatatacacatatacgtatatatatatatatatatatatt540tgttgttatcaattgccatagaatgattagttattgtgaatcaaatatttatcttgcagg600tg6022588DNA人工合成2tatctttattttgccatgacaagactgagctcagaagagtcaagcatttgcctaaggtcg60gacatgtcagaggcagtgccagacctatgtgagactctgcagctactgctcatgggccct120gtgctgcactgatgaggaggatcagatggatggggcaatgaagcaaaggaatcattctgt180ggataaaggagacagccatgaagaagtctatgactgtaaatttgggagcaggagtctcta240aggacttggatttcaaggaattttgactcagcaaacacaagaccctcacggtgactttgc300gagctggtgtgccagatgtgtctatcagaggttccagggagggtggggtggggtcagggc360tggccaccagctatcagggcccagatgggttataggctggcaggctcagataggtggtta420ggtcaggttggtggtgctgggtggagtccatgactcccaggagccaggagagatagacca480tgagtagagggcagacatgggaaaggtgggggaggcacagcatagcagcatttttcattc540tactactacatgggactgctcccctatacccccagctaggggcaagtg5883722DNA人工合成3acaaagacaagcacgtggacctgggaggagggttattgtccatgactggtgtgtggagac60aaatgcaggtttataatagatgggatggcatctagcgcaatgactttgccatcactttta120gagagctcttggggaccccagtacacaagaggggacgcagggtatatgtagacatctcat180tctttttcttagtgtgagaataagaatagccatgacctgagtttatagacaatgagccct240tttctctctcccactcagcagctatgagatggcttgccctgcctctctactaggctgact300cactccaaggcccagcaatgggcagggctctgtcagggctttgatagcactatctgcaga360gccagggccgagaaggggtggactccagagactctccctcccattcccgagcagggtttg420cttatttatgcatttaaatgatatatttattttaaaagaaataacaggagactgcccagc480cctggctgtgacatggaaactatgtagaatattttgggttccatttttttttccttcttt540cagttagaggaaaaggggctcactgcacatacactagacagaaagtcaggagctttgaat600ccaagcctgatcatttccatgtcatactgagaaagtccccacccttctctgagcctcagt660ttctctttttataagtaggagtctggagtaaatgatttccaatggctctcatttcaatac720aa7224287DNA人工合成4aagctgtgattccaaatattacgtaaatacacttgcaaaggaggatgtttttagtagcaa60tttgtactgatggtatggggccaagagatatatcttagagggagggctgagggtttgaag120tccaactcctaagccagtgccagaagagccaaggacaggtacggctgtcatcacttagac180ctcaccctgtggagccacaccctagggttggccaatctactcccaggagcagggagggca240ggagccagggctgggcataaaagtcagggcagagccatctattgctt2875300DNA人工合成5gctaaagggaagaataaattagagaaaaattggaatgactgaatcggaacaaggcaaagg60ctataaaaaaaattaagcagcagtatcctcttgggggcgcctcccgcacactatctcaat120gcaaacatctgtctgaaacggtccctggctaaactccacccatgggttggccagccttgc180cttaactgatagccttgacaaggcaaacttgaccaatagtcttagagtatccagtgaggc240caggggccggcggctggctagggatgaagaataaaaggaagcacccttcagcagttccac30061219DNA人工合成6acatttgcttctgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacaccatggtgcatc60tgactcctgaggagaagtctgccgttactgccctgtggggcaaggtgaacgtggatgaag120ttggtggtgaggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagacca180atagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactct240ctctgcctattggtctattttcccacccttaggctgctggtggtctacccttggacccag300aggttctttgagtcctttggggatctgtccactcctgatgctgttatgggcaaccctaag360gtgaaggctcatggcaagaaagtgctcggtgcctttagtgatggcctggctcacctggac420aacctcaagggcacctttgccacactgagtgagctgcactgtgacaagctgcacgtggat480cctgagaacttcagggtgagtctatgggacgcttgatgttttctttccccttcttttcta540tggttaagttcatgtcataggaaggggataagtaacagggtacagtttagaatgggaaac600agacgaatgattgcatcagtgtggaagtctcaggatcgttttagtttcttttatttgctg660ttcataacaattgttttcttttgtttaattcttgctgatacaatgtatcatgcctctttg720caccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaaggcaatagcaatatctctgca780tataaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagca840gctacaatccagctaccattctgcttttattttatggttgggataaggctggattattct900gagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacagct960cctgggcaacgtgctggtctgtgtgctggcccatcactttggcaaagaattcaccccacc1020agtgcaggctgcctatcagaaagtggtggctggtgtggctaatgccctggcccacaagta1080tcactaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtc1140caactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaa1200aaacatttattttcattgc12197349DNA人工合成7tgtagcttgatattcactactgtcttattaccctgtcataggcccaccccaaatggaagt60cccattcttcctcaggatgtttaagattagcattcaggaagagatcagaggtctgctggc120tcccttatcatgtcccttatggtgcttctggctctgcagttattagcatagtgttaccat180caaccaccttaacttcatttttcttattcaatacctaggtaggtagatgctagattctgg240aaataaaatatgagtctcaagtggtccttgtcctctctcccagtcaaattctgaatctag300ttggcaagattctgaaatcaaggcatataatcagtaataagtgatgata349

权利要求：1.一种HBB过表达载体，其特征在于，包括HBB表达模块；所述HBB表达模块包括串联放置的DNaseI高敏位点、启动子、HBB表达框和增强子；所述DNaseI高敏位点包括串联表达的HS4、HS3和HS2；所述HBB表达模块的长度小于4kb。2.根据权利要求1所述的HBB过表达载体，其特征在于，所述HS2的核苷酸序列上包含TAL1、GATA1、KLF1、NFE2、GR和SOX6反式因子的结合基序；优选地，所述HS2的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；优选地，所述HS3的核苷酸序列上包含GATA1、SOX6、TAL1、STAT5、NFE2和KLF1反式因子的结合基序；优选地，所述HS3的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；优选地，所述HS4的核苷酸序列上包含SOX6、TAL1、NFE2、GATA1、GFI1B和KLF1反式因子的结合基序；优选地，所述HS4的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。3.根据权利要求1或2所述的HBB过表达载体，其特征在于，所述启动子包括HBB启动子或突变型HBG启动子；优选地，所述HBB启动子的核苷酸序列上包含TAL1、GATA1、KLF1和TBP反式因子的结合基序；优选地，所述HBB启动子的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；优选地，所述突变型HBG启动子的核苷酸序列上包含GATA1、TAL1和TBP反式因子的结合基序；优选地，所述突变型HBG启动子的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。4.根据权利要求1-3任一项所述的HBB过表达载体，其特征在于，所述HBB表达框的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。5.根据权利要求1-4任一项所述的HBB过表达载体，其特征在于，所述增强子的核苷酸序列上包含SOX6、GATA1、KLF1、SPI1B、TAL1和GFI1B反式因子的结合基序；优选地，所述增强子的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示。6.一种如权利要求1-5任一项所述的HBB过表达载体的设计方法，其特征在于，所述方法包括对DNaseI高敏位点、启动子、HBB表达框和增强子进行精简的步骤；优选地，所述DNaseI高敏位点包括串联表达的HS4、HS3和HS2；优选地，所述启动子包括HBB启动子或突变型HBG启动子。7.根据权利要求6所述的设计方法，其特征在于，所述HBB启动子的设计方法包括对HBB启动子的转录起始元件进行截取的步骤；优选地，对所述突变型HBG启动子的设计方法包括对野生型HBG启动子的第-202至-113位核苷酸进行取代突变的步骤；优选地，所述取代包括第-202位、第-198位、第-195位、第-175位、第-117位、第-114位和第-113位的核苷酸被取代；优选地，所述突变位点包括-202CG、-198TC、-195CG、-175TC、-117GA、-114CT和-113AG。8.根据权利要求6或7所述的设计方法，其特征在于，所述HBB表达框的设计方法包括对HBB表达框的2号内含子进行精简的步骤；优选地，所述精简为删除2号内含子中的MIER1结合区域。9.一种如权利要求1-5任一项所述的HBB过表达载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1将如SEQIDNO:1-7所述的核苷酸序列通过酶切连接和同源重组的方式组装成完整的HBB表达模块；2将步骤1得到的HBB表达模块装载进入载体，得到所述HBB过表达载体；优选地，步骤2所述载体包括慢病毒载体或腺相关病毒载体。10.一种如权利要求1-5任一项所述的HBB过表达载体在制备地中海贫血治疗药物中的应用。

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