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申请/专利权人：南京启真基因工程有限公司
摘要：本发明公开了用于构建TARDBP基因突变的ALS模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。该基因编辑系统包含按照本发明所述方法制备的Cas9蛋白，针对TARDBP基因的gRNA以及含有TARDBP突变位点的单链DonorDNA。采用本发明构建并表达的Cas9高效蛋白联合体外转录的gRNA进行基因编辑，并对Cas9和gRNA的最佳用量配比进行了优化，配合合成的ssODN作为DonorDNA，最终获得靶标位点精确点突变的单细胞克隆比率高达22.5％，远高于常规的点突变效率5％。所构建的TARDBP基因突变猪细胞可用于进行体细胞克隆，生产肌萎缩侧索硬化症模型猪。
主权项：1.一种用于构建TARDBP基因突变的ALS模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统，其特征在于包含Cas9蛋白，针对TARDBP基因的gRNA以及含有TARDBP突变位点的单链DonorDNA；所述的针对TARDBP基因的gRNA的靶点选自SEQIDNO.15所示的TARDBP-E6-gRNA2和SEQIDNO.16所示的TARDBP-E6-gRNA3；所述的含有TARDBP突变位点的单链DonorDNA序列如SEQIDNO.27所示；所述Cas9蛋白的制备方法包含以下步骤：（1）培养含有SEQIDNO.1所示表达载体pKG-GE4的基因工程菌，加入IPTG，在低于前期培养温度5℃的温度下诱导所述的基因工程菌表达目的蛋白，并收集菌体沉淀；（2）粗提融合蛋白，采用Ni-NTA琼脂糖柱进行融合蛋白的纯化；（3）用带his标签的重组牛肠激酶酶切融合蛋白，并用Ni-NTA树脂纯化得到酶切后去除TrxA-His的NLS-spCas9-NLS目的蛋白。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 南京启真基因工程有限公司 用于构建TARDBP基因突变的ALS模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用
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