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申请/专利权人：上海海洋大学

摘要：本发明公开了一种淡水鱼类团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞系及其培养方法和应用，包括：选择团头鲂和杂交鲂鲌三倍体为对象，在室温条件下暂养2周，早晚各喂食一次，同时准备原代培养基、传代培养基和试剂，先进行原代培养30～40d，直至迁出的细胞覆盖培养瓶底部90％，依次经过传代、冻存和复苏后，得到团头鲂鳃细胞命名为MAG细胞，得到杂交鲂鲌三倍体鳃细胞命名为MCG细胞。本发明通过细胞组织迁出实现体外培养团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞，得到两株具有分裂能力强、生长速度快和复苏活力高的淡水鱼类团头鲂和杂交鲂鲌三倍体的鳃细胞系，应用于低氧胁迫环境，为后续实验提供可靠的体外研究工具。

主权项：1.一种淡水鱼类团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞系的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、选择团头鲂和杂交鲂鲌三倍体为对象，在室温为27～29℃的条件下暂养2周，早晚各喂食一次，同时准备原代培养基、传代培养基和试剂；步骤2、原代培养；包括：2-1用MS-222进行麻醉，然后用75％的酒精擦拭鱼体，移至超净工作台无菌取鳃组织，放于无菌培养皿内；2-2用含有8％青霉素-链霉素-两性B霉素，D-PBS作为漂洗液洗涤3次，洗去血液和多余粘液；2-3用无菌剪刀将组织切成1mm3小块，转移至25cm2的培养瓶中，加入完全培养基，28℃下静置培养，每3天更换培养基，用倒置荧光显微镜观察组织迁移状况；2-4原代培养30～40d，直至覆盖培养瓶底部90％，淡水鱼类团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞迁出；步骤3、团头鲂和鲂鲌杂交鳃细胞系的传代和冻存，包括：3-1将已经覆盖90％培养瓶的团头鲂鳃细胞和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞弃掉原培养基，D-PBS清洗1次；3-2加入2mL胰酶-EDTA消化液消化1min，待消化的细胞变圆逐渐脱落后，加入2mL的M199完全培养基中止消化；3-3补充2mL的M199完全培养基，吹散混匀后转移至25cm2培养瓶中，于28℃继续培养；3-4向长满的团头鲂鳃细胞和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞中加入2mL的胰酶-EDTA消化液消化1min，并加入2mL的M199完全培养基中止消化；3-51500rpmmin离心5min，用由90％FBS和10％DMSO组成的冻存液重悬细胞并转移至2mL冻存管中，得到的团头鲂鳃细胞命名为MAG细胞，杂交鲂鲌三倍体鳃细胞命名为MCG细胞；3-6在冻存管上注明细胞的名称、细胞数和冻存日期放入程序降温盒中-80℃过夜，转入液氮中储存；步骤4、团头鲂和鲂鲌杂交鳃细胞系的复苏，包括：4-1将冻存的MAG细胞和MCG细胞从液氮中取出，迅速放入37℃的无菌恒温水浴锅中30s，期间轻轻晃动直至细胞融化；4-2加1mLM199完全培养基，以1000rpmmin的转速离心5min，弃去上清液；4-3加入4mL完全培养基使细胞重悬，随后将其转入25cm2培养瓶，置于28℃恒温培养箱中，24小时后观察细胞生长状态，48h后更换培养液继续培养，完成复苏。

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百度查询： 上海海洋大学 一种淡水鱼类团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞系及其培养方法和应用