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申请/专利权人：安徽瑞邦生物科技有限公司
摘要：本发明公开了一种固定化酶法生产NADP+的方法，设计引物利用高保真酶从大肠杆菌基因组中扩增NADK基因，回收PCR产物，用NdeⅠ与BamHⅠ进行双酶切PCR产物NADK基因、pET42‑CBD骨架载体，将菌株pET42‑NADK‑CBD甘油管在LB平板活化，将单管菌液按3％的转接量转接至TB培养基中，加入0.2mMIPTG摇床诱导培养，菌液进行细胞破碎后进行SDS‑PAGE检测，在LB平板活化，再用20％甘油保藏于‑80℃。本发明使用的固定化酶的方法将NAD+转化为NADP+，与传统的游离酶催化相比，重复性高、副产物少、产物得率高、反应液澄清等特点，可极大降低后处理压力，降低成本损耗。
主权项：1.一种固定化酶法生产NADP+的方法，其特征在于，包括如下步骤：扩增目的片段：设计引物利用高保真酶从大肠杆菌基因组中扩增NADK基因；PCR产物回收：在PCR反应液中加入PCR回收试剂盒bufferA，混合后加入吸附柱离心，倒掉收集管中液体，再加入回收试剂盒bufferW离心，重复一次，最后在吸附膜中央加入超纯水45μl，回收PCR产物；酶切并回收酶切产物：用NdeⅠ与BamHⅠ进行双酶切PCR产物NADK基因、pET42-CBD骨架载体；连接基因与载体骨架：将pET42-CBD载体骨架与NADK基因通过T4DNA连接酶在16℃连接2h；转化连接产物：BL21DE3感受态从-80℃取出，插入冰中静置后热激，迅速放回冰上并静置，向离心管中加入LB培养基，混匀后复活，吸取涂布到含硫酸卡那霉素抗生素的LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养；将菌株pET42-NADK-CBD甘油管在LB平板活化，挑取平板上的单菌落转接至LB单管，将单管菌液按3％的转接量转接至TB培养基中，加入0.2mMIPTG摇床诱导培养，取菌液，测OD600值，菌液进行细胞破碎后进行SDS-PAGE检测，挑取高OD600、蛋白表达正常的单菌落进行混合，在LB平板活化，再用20％甘油保藏于-80℃。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 安徽瑞邦生物科技有限公司 一种固定化酶法生产NADP+的方法
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