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申请/专利权人:河南农业大学
摘要:本发明公开了一种鸡小肠类器官的培养基及培养方法,涉及类器官培养技术领域,该培养基主要包括:L‑WNR条件培养基、基础培养基、Wnt通路激活剂R‑Spondin‑1、BMP受体抑制剂Noggin、ROCK抑制剂Y‑27632、p38MAPK抑制剂SB202190、TGF‑β受体I型TGF‑βRI激酶抑制剂LY2157299、Laduviglusib具有口服活性的GSK‑3αβ抑制剂和Wntβ‑catenin信号通路激活剂和Notch信号激活剂Jagged‑1,以及其他特异性添加因子,该方法采用多种抗生素对小肠组织进行清洗,使用EDTA进行消化和涡旋振荡仪来分离小肠中的绒毛和隐窝,获得大量干净且密度高的肠隐窝细胞,大大提高了鸡小肠类器官样本的培养成功率,并减少污染。结合类器官的传代、冻存技术可以在有限时间内获得充足的类器官开展科学研究。
主权项:1.一种鸡小肠类器官的培养基及培养方法,包括分子培养基由L-WNR条件培养基和基础培养基组成,其特征在于:所述L-WNR条件培养基在分子培养基中的体积百分比浓度为50%,其余为基础培养基含10%胎牛血清和1%青霉素链霉素双抗;所述L-WNR条件培养基包括如下步骤制备而成:1制备L-WNR培养基:将10%胎牛血清、DMEM高糖培养基、1%青霉素链霉素双抗、0.5mgmLG418和0.5mgmL潮霉素B,按比例混匀,4℃保存备用;2在T75细胞培养瓶中加入预冷的19mLL-WNR培养基;3将冻存的L-WNR细胞加入预冷的L-WNR培养基进行缓慢吹打解冻,1200rpm离心3min后,向沉淀中再加入1mL新鲜的L-WNR培养基得L-WNR细胞溶液;4将1mLL-WNR细胞溶液转移至步骤2准备的装有L-WNR培养基的T75细胞培养瓶中,于37℃、5%CO2的细胞培养箱连续培养2~3d,至细胞完全长满T75培养瓶贴壁融合为止;5移除T75培养瓶中的L-WNR细胞培养基;6向移除L-WNR细胞培养基后的T75培养瓶中加入2mL0.25%胰蛋白酶溶液含EDTA,使其均匀覆盖T75培养瓶内壁的细胞层表面,于37℃培养箱解离3~5min,1200rpm,离心3min后,弃去旧培养基,加入1mL新鲜的基础培养基,得细胞悬液;7将细胞悬液转移至新的T75细胞培养瓶,再加入19mL新鲜的基础培养基于T75细胞培养瓶,在37℃,5%CO2培养箱培养1-2d,直至细胞完全长满T75培养瓶贴壁融合为止;8经步骤7培养后,移除旧的基础培养基,再加入20mL新鲜的基础培养基,于37℃,5%CO2培养箱继续培养24h,即得第一条件培养基;9每24h收集一次每个T75培养瓶中的条件培养基到50mL离心管,然后向T75培养瓶中加入20mL新鲜的基础培养基后,于37℃,5%CO2培养箱继续培养,一般收集3-4次,即为第二、第三、第四条件培养基;10将收集的所有L-WNR条件培养基于培养瓶中混匀后,置50mL离心管中,2500rpm,室温离心5min,吸取上清液至储存瓶中,于4℃保存;11将L-WNR条件培养基与基础培养基按体积比1:1混合,配制成体积百分比终浓度为50%的L-WNR条件培养基,可在-20℃保存一个月。
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