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申请/专利权人：武汉轻工大学
摘要：本发明公开了一种超表达小牛皱胃凝乳酶的乳酸克鲁维酵母缺失株的构建方法，包括以下步骤：S1、构建重组乳酸克鲁维酵母凝乳酶表达菌株，S2、缺陷株WH99Δcal1的构建与筛选，S3、构建缺陷株WH99Δcal1凝乳酶表达菌株。本发明通过CRISPRCas9破坏乳酸克鲁维酵母基因组上的KLcal1基因，将小牛凝乳酶编码序列重组到乳酸克鲁维酵母基因组上，经发酵后，得到目前在乳酸克鲁维酵母里小牛凝乳酶的最高酶活。菌株中没有被引入新的抗生素标记，可以进行多次基因编辑，更加方便高效。
主权项：1.一种超表达小牛皱胃凝乳酶的乳酸克鲁维酵母缺失株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、构建重组乳酸克鲁维酵母凝乳酶表达菌株：用PCR的方法得到小牛凝乳酶的基因片段，将乳酸克鲁维酵母表达载体pKLAC1用BglII和NotI双酶切，得到载体片段；将两个具有同源序列的片段用无缝克隆的方式重组得到重组载体pKLAC1-chy，将重组载体线性化后电转化乳酸克鲁维酵母得到重组菌株；S2、缺陷株WH99Δcal1的构建与筛选：利用CRISPRCas9去破坏乳酸克鲁维酵母里的钙连蛋白基因cal1提高凝乳酶的分泌；S3、构建缺陷株WH99Δcal1凝乳酶表达菌株：将构建好的重组表达载体pKLAC1-chy经SacI酶线性化后电转化至WH99Δcal1；所构建缺陷株WH99Δcal1凝乳酶的表达量比原始菌株提高了约3倍。其中，小牛凝乳酶原核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：小牛凝乳酶原蛋白质序列如SEQIDNO.2所示：乳酸克鲁维酵母基因组上KLcal1核苷酸序列如SEQIDNO.3所示：编辑后的KLcal1核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 武汉轻工大学 一种超表达小牛皱胃凝乳酶的乳酸克鲁维酵母缺失株的构建方法
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