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申请/专利权人：清华大学

摘要：本发明公开了一种还原氧化石墨烯膜及其制备方法。所述还原氧化石墨烯膜的制备方法包括如下步骤：将氧化石墨烯转移至电镜载网上，经还原即得；所述还原的步骤如下：在氩氢气的环境下，加热至300～600℃并恒温，实现对所述氧化石墨烯的还原。本发明还原氧化石墨烯膜的导电性更强，因而能够减少拍照曝光时电子造成的漂移；与氧化石墨烯相比，还原氧化石墨烯的导电性更高，减少光束照射带来的样品漂移问题。此外，还原氧化石墨烯的厚度更薄，因此透射电子显微镜照片的背景噪音也更低。本发明提供的还原氧化石墨烯膜能够给冷冻电镜的制样以及后期三维重构带来极大便利。

主权项：1.一种在生物冷冻电镜三维重构中应用的还原氧化石墨烯生物冷冻电镜载网支持膜的制备方法，包括如下步骤：步骤1：氧化石墨烯的制备：将3g石墨烯中加入体积比为9:1的H2SO4H3PO4混合溶液和高锰酸钾，加热至50℃并不断搅拌，反应结束后降至室温并在冰水浴中加入30％的H2O2溶液，再用滤器过滤去除较大片段，在室温下用4000rpm离心4h后去除上清，沉淀依次用200mLH2O、30％的HCl、无水乙醇重悬，上述重悬步骤之后采用4000rpm离心4h并去除上清，第二次用无水乙醇重悬离心后在真空干燥箱中干燥备用；步骤2：氧化石墨烯的转移：将氧化石墨烯转移至电镜载网上，经还原即得到还原氧化石墨烯电镜载网支持膜；在转移所述氧化石墨烯之前，对所述电镜载网进行薄空气辉光放电亲水化处理；采用下述步骤超声分散所述氧化石墨烯：取1mL溶于水中的氧化石墨烯，加入7mL分散缓冲液混匀，超声处理10min；将超声后的溶液均分于6个1.5mLEP管中，4000g常温离心10min；去除上清液Ⅰ并在每个所述EP管加入500μL所述分散缓冲液重悬，然后超声处理2min；500g常温低速离心1min，将上清液Ⅱ转移至新的EP管，用锡纸包裹置于4℃保存；所述分散缓冲液为体积比为1：5的水与甲醇的混合液；按照下述步骤转移所述氧化石墨烯：将电镜载网进行稀薄空气辉光放电亲水化处理，条件为：将载网放置于密闭容器中，抽真空至10-3～10-4托后，low档电压处理10s；容器洗净后装蒸馏水至刚好没过四根短棒，将容器底部金属片置于所述短棒上；剪一张和金属片大小相仿的滤纸铺在金属片上，然后将处理后的载网正面朝上置于滤纸上；向液面缓慢轻柔且均匀地滴加200μL所述上清液Ⅱ，之后打开出水管的阀门，让容器中的水缓慢流出；取出滤纸并置于培养皿中使载网自然干燥；所述还原的步骤如下：在氩氢气的环境下，加热至300~600℃并恒温，实现对所述氧化石墨烯的还原；所述氩氢气的流速为80~120sccm；所述加热步骤中的升温速率为2~5℃min；所述氩氢气中氩气的体积含量为90~98%；所述恒温的时间为60~100min；所述还原氧化石墨烯生物冷冻电镜载网支持膜用于生物大分子的三维重构，所述生物大分子为20S蛋白酶体、去铁铁蛋白和核糖体，所述生物大分子的三维重构通过电子断层扫描法进行，其中收集电子断层扫描照片时，每张照片的电子辐照剂量为3eÅ2s，总剂量为100eÅ2，放大倍数为64000×；采用透射电子显微镜检测还原氧化石墨烯的完整性和覆盖率，达到80%~90%的覆盖度，且层数达到单层，石墨烯均匀覆盖在电镜载网上，降低了样本在冷冻电镜成像中的背景噪音。

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