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申请/专利权人：湖北冠众通科技有限公司

摘要：本发明提供了一种产法尼醇基因工程菌的构建方法，是利用同源重组的方式在酿酒酵母中整合表达MVA途径限速酶‑截短形式的HMG‑CoA还原酶编码基因（tHMG1）和整合融合表达FPP合酶编码基因（ERG20）与酿酒酵母内源性磷酸酶编码基因（PAH1），以增强MVA途径代谢强度，增强法尼醇的表达。同时使用铜离子诱导启动子pCUP1替换角鲨烯合酶编码基因ERG9启动子，下调麦角固醇竞争途径，提高法尼醇产量；最终获得产法尼醇的基因工程菌株。该基因工程菌的法尼醇的摇瓶发酵产量可达到约573mgL，发酵罐产量可达到约21gL，完全具备商业化生产水平，具有良好的工业应用前景。

主权项：1.一种产法尼醇基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、构建酿酒酵母MVA途径相关基因表达模块：过表达tHMG1模块，包括诱导型双向强启动子pGAL1-10和MVA途径限速酶编码基因tHMG1，所述pGAL1-10的核苷酸序列如SEQNO.1所示，所述tHMG1的核苷酸序列如SEQNO.2所示；S2、构建法尼醇生产相关基因表达模块：ERG20-Linker-PAH1模块，包括FPP合酶的编码基因ERG20和酿酒酵母内源性磷酸酶的编码基因PAH1，所述ERG20的核苷酸序列如SEQNO.3所示，所述PAH1的核苷酸序列如SEQNO.4所示；S3、构建敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的工程菌：将步骤S1所述酿酒酵母MVA途径相关基因表达模块和步骤S2所述法尼醇生产相关基因表达模块整合至半乳糖调节蛋白GAL80基因位点，同时敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因，得到敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块，将所述敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块转化至宿主菌酿酒酵母中，经多次基因工程操作，获得敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的基因工程菌；所述宿主菌酿酒酵母为酿酒酵母30000B、酿酒酵母S.cerevisiaeCEN.PK2-1D或者酿酒酵母BY4741中任一种；S4、构建角鲨烯合酶途径下调表达质粒，包括将铜离子诱导启动子pCUP1替换为角鲨烯合酶基因ERG9启动子，所述pCUP1的核苷酸序列如SEQNO.5所示；所述角鲨烯合酶基因ERG9启动子取至ERG9基因起始密码子前450bp，其核苷酸序列如SEQNO.6所示；S5、将步骤S5所述角鲨烯合酶途径下调表达质粒转化至步骤S3所述的敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的基因工程菌中，依次经抗生素抗性筛选，然后通过菌落PCR验证，获得高产法尼醇基因工程菌；所述构建方法还包括两个终止子tCYC1和tERG20，所述终止子tCYC1的核苷酸序列如SEQNO.7所示，所述终止子tERG20的核苷酸序列如SEQNO.8所示。

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百度查询： 湖北冠众通科技有限公司 一种产法尼醇基因工程菌及其构建方法与应用