买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：湖北冠众通科技有限公司

摘要：本发明提供了一种酿酒酵母基因工程菌，是通过将酿酒酵母菌中的GAL4启动子替换为铜离子抑制启动子pCTR1或pCTR3，将GAL80启动子替换为铜离子诱导启动子pCUP1构建而成，该工程菌在种子培养期，受铜离子作用会抑制GAL基因调控系统中控制外源基因的pGAL1，pGAL2，pGAL7和pGAL10启动子的表达，避免了产物过早生产，显著提高了传代稳定性。而且该工程菌的GAL基因调控系统不受半乳糖浓度的影响，提高了萜类化合物生物表达，其构建方法简单，生产成本低，发酵生产阶段，无需添加任何诱导剂即可实现目标产物的生产，适合大规模生产，该工程菌在萜类化合物的生产领域有着巨大的应用前景。

主权项：1.一种酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母基因工程菌的构建方法包括以下步骤：S1、构建含启动子pCTR1的GAL4模块重组质粒pCuZ100，或者构建含启动子pCTR3的GAL4模块重组质粒pCuZ101；所述pCTR1的核苷酸序列如SEQNO.1所示，所述pCTR3的核苷酸序列如SEQNO.2所示；所述pCTR1或者pCTR3替换的GAL4的启动子为GAL4基因起始密码子前456bp，核苷酸序列如SEQNO.3所示；构建重组质粒pCuZ100的方法包括以下步骤：S11、以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用pGAL4-left-F和pGAL4-left-R、pCTR1-F和pCTR1-R、pGAL4-right-F和pGAL4-right-R引物进行PCR反应，获得DNA片段pGAL4-left、pCTR1和pGAL4-right；所述pGAL4-left-F的核苷酸序列如SEQNO.6所示，所述pGAL4-left-R的核苷酸序列如SEQNO.7所示，所述pCTR1-F的核苷酸序列如SEQNO.8所示，所述pCTR1-R的核苷酸序列如SEQNO.9所示，所述pGAL4-right-F的核苷酸序列如SEQNO.10所示，所述pGAL4-right-R的核苷酸序列如SEQNO.11所示；S12、以质粒载体pFZ202为模板，用引物G418-1-F和G418-1-R进行PCR反应，获得G418表达盒G418-1；所述G418-1-F的核苷酸序列如SEQNO.12所示，所述G418-1-R的核苷酸序列如SEQNO.13所示；S13、将步骤S1获得的DNA片段pGAL4-left、pCTR1和pGAL4-right和步骤S2获得的表达盒G418-1，通过用引物pGAL4left-F和pGAL4-right-R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得DNA片段G418_pCTR1；S14、将步骤S4获得的DNA片段G418_pCTR1与质粒pMD19-T连接，获得重组质粒载体，记为pCuZ100；构建重组质粒pCuZ101方法包括以下步骤：S111、以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用pGAL4-left-F和pGAL4-left-R、pCTR3-F和pCTR3-R、pGAL4-right-1-F和pGAL4-right-R引物进行PCR反应，获得DNA片段pGAL4-left、pCTR3和pGAL4-1-right；所述pCTR3-F的核苷酸序列如SEQNO.14所示，所述pCTR3-R的核苷酸序列如SEQNO.15所示，所述pGAL4-right-1-F的核苷酸序列如SEQNO.16所示；S112、以质粒载体pFZ202为模板，用引物G418-1-F和G418-2-R进行PCR反应，获得G418表达盒G418-2；所述G418-2-R的核苷酸序列如SEQNO.17所示；S113、将步骤S1获得的DNA片段pGAL4-left、pCTR3和pGAL4-1-right和步骤S2获得的表达盒G418-2，通过用引物pGAL4-left-F和pGAL4-right-R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得DNA片段G418_pCTR3；S114、将步骤S4获得的DNA片段G418_pCTR3与质粒pMD19-T连接，获得重组质粒载体，记为pCuZ101；S2、构建含启动子pCUP1的GAL80模块重组质粒pCuZ102；所述pCUP1的核苷酸序列如SEQNO.4所示；所述pCUP1替换的GAL80的启动子为GAL80基因起始密码子前426bp，核苷酸序列如SEQNO.5所示；构建重组质粒pCuZ102的方法包括以下步骤：S21、以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用pGAL80-left-F和pGAL80-left-R、pCUP1-F和pCUP1-R、pGAL80-right-1-F和pGAL80-right-R引物进行PCR反应，获得DNA片段pGAL80-left、pCUP1和pGAL80-right；所述pGAL80-left-F的核苷酸序列如SEQNO.18所示，所述pGAL80-left-R的核苷酸序列如SEQNO.19所示，所述pCUP1-F的核苷酸序列如SEQNO.20所示，所述pCUP1-R的核苷酸序列如SEQNO.21所示，所述pGAL80-right-1-F的核苷酸序列如SEQNO.22所示，所述pGAL80-right-R的核苷酸序列如SEQNO.23所示；S22、以质粒载体pFZ202为模板，用引物Hyg-1-F和Hyg-1-R进行PCR反应，获得潮霉素表达盒Hyg；所述Hyg-1-F的核苷酸序列如SEQNO.24所示，所述Hyg-1-R的核苷酸序列如SEQNO.25所示；S23、将步骤S1获得的DNA片段pGAL80-left、pCUP1和pGAL80-right步骤S2获得的表达盒Hyg，通过用引物pGAL80-left-F和pGAL80-right-R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得DNA片段Hyg_pCUP1；S24、将步骤S4获得的DNA片段Hyg_pCUP1与质粒pMD19-T连接，获得重组质粒载体，记为pCuZ102；S3、将步骤S1和步骤S2所得的重组质粒转入酿酒酵母GS-A3，所述GS-A3于2021年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为.CCTCCNO：M20211191，依次经抗生素抗性筛选，然后通过菌落PCR获取GAL4的启动子为pCTR1和GAL80的启动子为pCUP1的阳性菌落；或者通过菌落PCR获取GAL4的启动子为pCTR3和GAL80的启动子为pCUP1的阳性菌落；即得到酿酒酵母基因工程菌。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 湖北冠众通科技有限公司 一种酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用