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申请/专利权人：山东银丰生命科学研究院;银丰生物工程集团有限公司

摘要：本发明公开了一种抗AMH蛋白的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：1以AMH蛋白为免疫原，以6周龄BALBc雌性小鼠为对象进行免疫；选取效价高的免疫小鼠进行加强免疫；2取小鼠的脾脏，制备脾脏细胞悬液，与处于对数期的SP20骨髓瘤细胞混合，进行细胞融合，培养，得到能稳定分泌特异性抗AMH蛋白抗体的杂交瘤细胞株；3选取8～10周龄的BALBc雌性小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂，7天后注射杂交瘤细胞株，抽取小鼠腹水，提取、纯化，即得抗AMH蛋白的单克隆抗体。本发明的抗AMH单克隆抗体的制备方法能够得到效价高、亲和力强、特异性好的单克隆抗体，本发明为AMH的临床诊断提供了辅助。

主权项：1.一种抗AMH单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1小鼠免疫及杂交瘤细胞初筛以AMH蛋白为免疫原，以6周龄BALBc雌性小鼠为对象进行免疫，免疫三次，腹腔注射，每次免疫的时间间隔为10天，每只小鼠注射乳化抗原体积控制在100μL～300μL；其中，首次免疫时，将100μg只AMH蛋白与等体积的弗氏佐剂充分乳化，腹腔注射免疫；第二次免疫、第三次免疫同样使用100μg只AMH蛋白与等量不完全弗氏佐剂混合；第三次免疫一周后，采血，分离血清进行间接ELISA检测，检测小鼠体内抗AMH蛋白抗体的效价；选取效价达到1×103的免疫小鼠，进行加强免疫：腹腔注射不加佐剂的AMH蛋白，200μg只；2细胞融合和杂交瘤细胞的筛选加强免疫72小时后，取小鼠的脾脏，制备脾脏细胞悬液；将脾脏细胞悬液和处于对数期的SP20骨髓瘤细胞以数量比1:10的比例混合，进行细胞融合；细胞融合后，培养至第13天，对杂交瘤细胞进行间接ELISA检测，检测抗体效价以确定是否有阳性抗体；通过有限稀释法对阳性的杂交瘤细胞进行克隆化，经过4次亚克隆，得到能稳定分泌特异性抗AMH蛋白抗体的杂交瘤细胞株；3单克隆抗体的制备选取8～10周龄的BALBc雌性小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂，7天后注射杂交瘤细胞株，2×106～3×106个只，正常饲养小鼠；待小鼠腹部明显膨大，抽取小鼠腹水，提取、纯化，即得抗AMH蛋白的单克隆抗体。

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