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申请/专利权人：中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心)

摘要：本发明提供一种ISG15、DDIT4和IFNAR1三基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系的构建方法和应用。本发明中，利用CRISPRCas9技术对永生化的猪肺泡巨噬细胞系mPAM依次敲除ISG15、DDIT4和I型干扰素受体基因IFNAR1，命名为mPAM‑ISG15‑‑IFNAR1‑‑DDIT4‑‑细胞系。同时敲除ISG15、DDIT4和IFNAR1的mPAM可促进病毒的复制，显著提高病毒的滴度，而且三基因敲除后对细胞的活性无显著影响。为非洲猪瘟病毒工业化生产奠定了基础，对非洲猪瘟这一重大动物疫病的防控和生猪养殖具有重要的意义。

主权项：1.一种采用CRISPRCas9技术对猪肺泡巨噬细胞系mPAM中的ISG15、IFNAR1和DDIT4基因敲除的方法，所述方法包括以下步骤：1、针对猪的ISG15，IFNAR1和DDIT4每个基因，均设计了2条sgRNA，sgRNA进行退火合成带黏末端的双链DNA，将DNA片段插入到用ESP3I限制性内切酶切割的lentiCRISPRv2载体中，得到针对三个基因的表达Cas9蛋白的各两个sgRNA表达载体：LentiCRISPRv2-ISG15-sgRNA1，LentiCRISPRv2-ISG15-sgRNA2，LentiCRISPRv2-IFNAR1-sgRNA1，LentiCRISPRv2-IFNAR1-sgRNA2，LentiCRISPRv2-DDIT4-sgRNA1，LentiCRISPRv2-DDIT4-sgRNA2。2、使用脂质体转染法将ISG15的两个sgRNA质粒载体共转染至猪永生化肺泡巨噬细胞系mPAM内，对转染后的mPAM利用嘌呤霉素筛选和有限稀释法筛选得到成功敲除ISG15的mPAM。然后，将IFNAR1的两个sgRNA质粒载体共转染至敲除ISG15的mPAM细胞上，对转染后的mPAM利用嘌呤霉素筛选和有限稀释法筛选得到成功敲除ISG15和IFNAR1的猪肺泡巨噬细胞；最后将DDIT4的两个sgRNA质粒载体共转染至ISG15和IFNAR1双敲除的PAM细胞上，对转染后的mPAM细胞利用嘌呤霉素筛选和有限稀释法筛选得到ISG15，IFNAR1和DDIT4三基因敲除的mPAM。

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百度查询： 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) ISG15、IFNAR1和DDIT4三基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系的构建方法和应用