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申请/专利权人：重庆市畜牧科学院;生猪技术创新中心(重庆)

摘要：本发明提供一种基于RAA的猪轮状病毒A群快速检测方法，涉及病毒检测领域，包括如下步骤：检测靶标序列的选择，阳性标准品的制备，设计扩增引物，特异性引物对的筛选，PoRVA荧光RAA验证；本发明以PoRV的A群NSP4的3’UTR区域为检测靶标，建立荧光RAA检测技术对猪的A群轮状病毒进行检测，在PoRVA核酸检测方面具有高效的扩增、低检测限、温度范围适用性、良好的特异性和重复性等显著的优势，将在猪的A群轮状病毒迅速检测和疫情控制中发挥重要作用。

主权项：1.一种基于RAA的猪轮状病毒A群快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1检测靶标序列的选择PoRV基因组由11个RNA片段组成，其病毒粒子编码6个结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7和6个非结构蛋白NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5、NSP6，在6个非结构蛋白中选取NSP4基因中相对保守的UTR区域；2阳性标准品的制备以步骤1PoRVA的NSP4基因中相对保守区域为为模板进行合成，并克隆到载体pUC57vecter中，从而得到包含目的片段的重组质粒pUC57-vecter-PoRVA-NSP4；将重组质粒转化大肠杆菌E.coliDH5α中培养，扩增重组质粒并提取重组质粒作为阳性标准品，所获质粒用超微量紫外分光光度计进行质粒浓度测定85.3±0.4ngμL，并进行拷贝数计算，并将阳性标准品稀释，-20℃保存备用；3设计扩增引物根据步骤1中NSP4基因中相对保守区域，利用RAA引物设计软件设计3对引物，并经过BLAST验证其特异性；将RAA引物分成6组，其6组RAA引物为F1R1、F1R2、F2R1、F2R2、F3R1、F3R2；4特异性引物对的筛选将阳性标准品按RAA核酸扩增标准进行扩增，扩增结束后用1：1氯仿和苯酚混合溶液对扩增产物进行纯化，纯化后产物通过3％的琼脂糖凝胶电泳进行分析，筛选出电泳图目的条带明亮且呈现特异性扩增的引物组合；5PoRVA荧光RAA验证5-1荧光RAA检测探针的选择；5-2荧光RAA扩增有效性检测；5-3荧光RAA扩增特异性检测。

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