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申请/专利权人：深圳源兴基因技术有限公司

摘要：本发明涉及生物病毒技术领域，公开了一种高效去除HCD残留的痘苗病毒纯化工艺，方法步骤包括如下：首先对病毒收获液进行澄清处理；然后用中空纤维柱对澄清液进行浓缩和洗滤；接着对浓缩液进行酶切处理；最后使用复合层析对酶切样品进行精纯，最终样品HCD残留量可降至10ng剂量以下。该高效去除HCD残留的痘苗病毒纯化工艺，有效减少病毒聚集体的形成，极大地提高了酶切去除HCD的效率，仅通过酶切就可以将HCD降至10ng剂量以下，避免了使用离子交换层析从而影响产量以及增加无菌风险，适用于痘苗病毒从实验室规模至商业化的生产，直接避免使用离子交换层析，纯化工艺更加简单。

主权项：1.一种高效去除HCD残留的痘苗病毒纯化工艺，其特征在于，方法步骤包括如下：S1、首先对病毒收获液进行澄清处理：病毒收获液用孔径0.45μm~5μm的过滤器或孔径0.45μm~0.65μm的中空纤维柱进行澄清处理；S2、然后用中空纤维柱对澄清液进行浓缩和洗滤：用100KD~0.1μm中空纤维柱或膜包将澄清液浓缩至目标浓度，然后用洗滤液将浓缩液洗滤3~8次，排空中空纤维柱管路，收集浓缩液；S3、接着对浓缩液进行酶切处理：向浓缩液中加入终浓度为10~1000mM的NaCl、0.1%~3%的聚山梨酯80或聚山梨酯20和5~250UmL的核酸酶，酶切反应20min以上；S4、最后使用复合层析对酶切样品进行精纯，最终样品HCD残留量可降至10ng剂量以下：将复合层析填料用NaOH溶液消毒以及缓冲液平衡后将酶切收样品上样和洗脱收集病毒峰；其中，步骤S3中，酶切处理的具体步骤包括如下：S601，准备酶切反应体系：首先，需要准备酶切反应所需的试剂和溶液，包括NaCl母液、聚山梨酯80或聚山梨酯20溶液，以及核酸酶；S602，向浓缩液中添加物料：根据样品中HCD的含量，向样品中加入终浓度为10~1000mM的NaCl母液、0.1%~3%的聚山梨酯,5~250UmL的核酸酶，并混合均匀；S603，控制酶切反应条件：酶切反应在恒定的温度下进行，用于确保酶切效率和病毒样品的稳定性，控制反应的pH值和离子强度，以维持酶的最佳活性；S604，进行酶切反应：在添加了物料并设置适当的反应条件后，开始进行酶切反应；S605，终止酶切反应：当酶切反应达到预定时间或达到预期效果时，终止酶切反应，采用调整反应体系的pH值或添加酶抑制剂来实现；S606，后续处理：酶切反应结束后，对反应产物进行进一步的处理，包括离心、过滤或浓缩，用于去除多余的酶和其他杂质，得到更纯净的病毒样品；步骤S4中，复合层析进行精纯的具体方法步骤包括如下：S701，选择复合层析填料，包括CaptoCore400或CaptoCore700；S702，将选定的复合层析填料用NaOH溶液进行消毒处理，用于去除可能存在的微生物污染，使用适当的缓冲液对填料进行平衡，用于确保层析柱内的环境稳定且适合病毒的吸附和洗脱；S703，将经过酶切处理的样品上样至已准备好的复合层析柱中，在上样过程中，控制上样体积，将上样体积控制在30%CV以下；S704，使用缓冲液洗脱病毒，洗脱过程中密切关注洗脱液的紫外吸收情况，收集病毒峰；S705，对收集到的病毒峰进行分析和检测，用于确保其纯度和HCD残留量达到预期标准，使用凝胶电泳、PCR或质谱方法来检测病毒的纯度和HCD残留量。

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