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申请/专利权人：中南大学

摘要：本发明涉及生物医药技术领域，公开了HDAC的抑制剂丙戊酸Valproicacid,VPA在RSV感染中的治疗方法，其方法包括以下步骤：S1：细胞培养与RSV感染，S2：Westernblot检测VPA对HDAC12和GIMAP7表达的影响，S3：CCK8检测VPA对Beas‑2b和PC9细胞毒性，S4：RT‑qPCR检测RSV,HDAC12的表达以及RSV病毒载量，S5：间接免疫荧光检测RSV的荧光信号，S6：动物模型，S7：HE染色，S8：酶联免疫吸附试验ELISA，S9：统计学分析。本发明的VPA调控表观遗传标志发挥抗病毒，在构建的体内体外的RSV感染模型中验证了VPA通过影响HDAC12而提高GIMAP7的表达，进而抑制RSV的能力。

主权项：1.HDAC的抑制剂丙戊酸在RSV感染中的治疗方法，其特征在于：其方法包括以下步骤：S1：细胞培养与RSV感染人正常肺上皮细胞系Beas-2b、PC9和Hela由中南大学基础医学院微生物系所冻存和保留，RSVLongstrainA2typewasstoredbytheDepartmentofMedicalMicrobiologyofCentralSouthUniversity，在无菌条件下培养细胞，并在含有10％胎牛血清的DMEM和1640培养基37℃培养箱，5％CO2中培养；S2：Westernblot检测VPA对HDAC12和GIMAP7表达的影响取细胞生长状态良好的Beas-2b细胞铺于六孔板中；待细胞贴壁后，加入不同浓度的小分子化合物丙戊酸0mM、0.5mM、1mM和2mM,分别作用24h后，提取细胞RNA和细胞蛋白进行进一步实验；S3：CCK8检测VPA对Beas-2b和PC9细胞毒性细胞毒性试验采用CellCountingKit-8检测，Beas-2b在96孔细胞培养板的密度2×103个细胞，加入不同浓度的丙戊酸0mM、1mM、2mM、5mM、10mM和20mM；S4：RT-qPCR检测RSV,HDAC12的表达以及RSV病毒载量建立小分子化合物细胞组和DMSO对照组，从Hela的Beas-2b细胞中制备总RNA，并用SmartSpecTMPlus分光光度计进行定量，使用Trizol试剂从肺组织中提取总RNA，使用RR036APrimeScriptRTMasterMix将每个样本逆转录为cDNA，按照说明书使用2×SYBRGreenqPCRMasterMix进行扩增；S5：间接免疫荧光检测RSV的荧光信号4％多聚甲醛固定和0.4％Triton-X100通透Beas-2b细胞，肺组织切片在95％乙醇和0.1％triton-x100中固定，用正常山羊血清封闭20分钟，加入RSV主要表面糖蛋白G单克隆抗体兔一抗4℃孵育过夜，第二天，用PBST洗切片3次，每次4min，滴加稀释的山羊抗兔IgGCY3二抗，37℃孵育1h，再PBST浸洗3次，每次4min，滴加DAPI后避光孵育5min复染核，最后PBST清洗切片5次，每次4min后封片在共聚焦激光扫描显微镜下对样品进行观察拍照；S6：动物模型准备18只、4-6周龄、雌性、BALBc小鼠，经随机手段把小鼠归入健康对照组、RSV感染组、丙戊酸药物干预组400mgkg，各组动物都于标准条件下先对环境适应5-7d；异氟醚麻醉小鼠后，鼻内接种RSV5×106pfu100μl；S7：HE染色每只动物的肺组织在10％甲醛溶液中固定24小时，然后石蜡包埋，切成5μm薄片，按照常规实验程序进行苏木精-伊红染色，并在光学显微镜下观察组织形态学变化；S8：酶联免疫吸附试验ELISA收集小鼠肺匀浆，使用ELISA试剂盒测定IL-1β、IL-6和TNF-α水平，小鼠肺匀浆4℃1000rpm离心10min；S9：统计学分析借助Excel，开展原始计数资料的整合与分析工作；借助ImageJ，对一系列原始图片开展数字化处理工作，同时展示量化数据；借助GraphPadPrism8软件，针对原始计数资料和量化数据，开展处理分析工作；利用t检验，对符合正态分布的计量资料开展正态性分布检验，利用非参数检验，对不符合正态分布的计量资料开展正态性分布检验，以上分析结果利用均数±标准误Mean±SEM表示，当p＜0.05时，则具有统计学差异。

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