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申请/专利权人：西安昆创融源生物科技有限公司
摘要：本发明涉及的是一种重组人源胶原蛋白Ⅲ片段串联体的制备方法，重组人源胶原蛋白Ⅲ片段串联体的氨基酸序列如SEQNO.2所示，含396个氨基酸，单体分子量为46kDa，三聚体分子量为138kDa。其制备方法为：组成型分泌表达重组人源胶原蛋白Ⅲ片段串联体的毕赤酵母工程菌的构建，筛选获得高效表达的毕赤酵母工程菌；对重组酵母进行高密度发酵培养，实现重组人源胶原蛋白Ⅲ片段串联体高效表达；从发酵液中分离纯化重组人源胶原蛋白Ⅲ片段串联体蛋白。本发明重组人源胶原蛋白Ⅲ片段串联体是完全由人源胶原蛋白Ⅲ片段组成的全新氨基酸序列，其编码的基因是全新的人工基因序列；本发明较易地实现了该胶原蛋白工程菌的发酵生产。
主权项：1.一种重组人源胶原蛋白Ⅲ片段串联体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：步骤一、构建表达重组人源胶原蛋白Ⅲ片段串联体的毕赤酵母工程菌，筛选获得高效表达的毕赤酵母工程菌:1）根据毕赤酵母的密码子偏好性，以人胶原蛋白Ⅲ串联片段的氨基酸顺序为基础，利用毕赤酵母高频密码子对其进行优化，添加TGA终止密码，全长1191bp，命名为396C,基因优化结果如SEQNO.3所示；2）将优化后的基因通过无缝合成，插入到毕赤酵母组成型分泌表达载体pGAPZaA中；然后转化大肠杆菌，构建和筛选含有pGAPZa-396的阳性菌株；将线性化的pGAPZa-396CDNA，转化入巴氏毕赤酵母SDM1168中，进行人源胶原蛋白Ⅲ片段串联体的表达，筛选得的巴氏毕赤酵母基因工程菌；步骤二、对重组酵母进行高密度发酵培养，实现重组人源胶原蛋白Ⅲ片段串联体高效表达；步骤三、从发酵液中分离纯化重组人源胶原蛋白Ⅲ片段串联体蛋白。
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