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申请/专利权人：开平牵牛生化制药有限公司

摘要：本发明涉及酶合成技术领域，且公开了一种磁性固定化酶结合弱电场合成辅酶A的方法，包括以下步骤：S1、菌体种子培养；S2、发酵培养；S3、收集菌体和保存；S4、磁性固定化载体制备及产氨短杆菌胞内酶蛋白固定化；S5、磁性固定化辅酶A合成酶合成辅酶A。使用磁性固定化酶结合弱电场合成辅酶A，单位效价高，合成时间短，还原型辅酶A氧化减少，后期无需加入巯基乙醇进行还原。破碎产氨短杆菌，使辅酶A合成需要的几种酶蛋白游离，采用活化的羟基树脂载体对纯化后的辅酶A合成酶进行固定化，固定化条件温和，蛋白固定率高，酶失活少，磁性固定化酶稳定性好，一次投入催化泛酸、三磷酸腺苷、半胱氨酸合成辅酶A，速度快。

主权项：1.一种磁性固定化酶结合弱电场合成辅酶A的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、菌体种子培养：将产氨短杆菌接种在液体培养基上，并在30~40℃，220rpm培养24h；S2、发酵培养：将步骤S1中合格的摇瓶种子以10%的接种量接种于种子罐培养基上，并在30~40℃，220rpm培养24h；S3、收集菌体和保存：将步骤S2中发酵培养所得液体，经离心分离菌体和上清后，得菌体细胞，并在-20℃低温保存；S4、磁性固定化载体制备及产氨短杆菌胞内酶蛋白固定化：在容器中加入聚乙烯醇、超顺磁性Fe3O4纳米颗粒、氯化钠、去离子水，使其充分溶解，然后加入混匀的甲基丙烯酸羟乙酯，二乙烯苯及混合致孔剂正庚烷和乙酸乙酯，200-300rpm搅拌升温至75℃反应2小时，然后升温至85℃反应3小时，最后升温至95℃固化6小时；制得的树脂载体先用热水清洗，再用丙酮提取8小时，50-60℃真空干燥；干燥完成使用铷磁铁对磁性载体进行筛选，能被吸附的保留，排除不带磁性的固定化载体；将产氨短杆菌的菌体细胞取出解冻按15%浓度于500mM咪唑-50mMPBS-200mMNaCl中溶解，经高压均质机破碎释放出胞内辅酶A合成酶，4000-5000rpm离心得辅酶A合成酶液，辅酶A合成酶液按30-60mg蛋白1g已活化的磁性羟基树脂载体搅拌4小时或以上，使载体上亚氨基碳酸基团与酶分子上的氨基反应，固定化得磁性固定化辅酶A合成酶；S5、磁性固定化辅酶A合成酶合成辅酶A：将磁性固定化酶A合成酶加入到弱电场反应罐中，纯化水清洗磁性固定化酶A合成酶后，滤干后备用，磁性固定化辅酶A合成酶与底物反应液的质量体积比=1:10～5:10；将反应液泵至弱电场反应罐，设定弱电场控制器电压12V，电流2A，在温度32-39℃的条件下酶催化搅拌反应生成辅酶A。

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