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申请/专利权人：苏州南医大创新中心

摘要：一种干细胞来源的类原肠胚模型及其构建方法和应用。所述类原肠胚模型由人多能干细胞在体外构建得到，一定程度模拟了早期胚胎发育的生物学事件与胚胎的关键结构，如原始内胚层发育、双胚盘建立、羊膜腔和羊膜细胞的出现以及原条出现等，且在蛋白水平和转录组水平均得到验证，能够较好的复现围植入期到原肠胚阶段胚胎的关键特征，并且该模型可以批量诱导作为早期胚胎药物及环境毒物等的筛选模型，从而对某些临床孕早期患者的用药等提供安全性测试。

主权项：1.一种类原肠胚模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤，（1）在多能干细胞长至80-90%汇合度时将细胞消化为单细胞，使用PBS将细胞进行重悬，得到细胞悬液1；取细胞悬液1加入含有Y-27632的G1ER培养基进一步重悬细胞，得到细胞悬液2；将细胞悬液2接种到提前使用抗黏附溶液进行包被的类胚体培养板中，离心；培养第二天采用G1ER培养基换半液，每天换半液至培养直至形成原始内、外胚盘；（2）将（1）培养板各孔中的G1ER培养基弃去12~34体积后加入G2EE培养基培养，进行羊膜腔预诱导；（3）将（2）培养板各孔中的G2EE培养基弃去12~34体积后加入aG2EE培养基培养，诱导形成羊膜细胞；（4）将（3）培养板各孔中的aG2EE培养基弃去12~34体积后加入bG2EE培养基培养；直至诱导得到羊膜细胞、原条细胞、原始生殖细胞，获得植入后类原肠胚模型；步骤（1）所述G1ER培养基的成分包含：体积百分比为50%的G-1TMPlus卵裂球培养基、25%的Essential8培养基和25%的RACL培养基；所述RACL培养基包含：体积百分比为95%-98.5%的含有GlutaMAX的基础培养基RPMI1640、体积百分比为1%的B27添加剂、体积百分比为0.5%的青霉素-链霉素双抗、0.1 mM非必须氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇，100ngml重组人激活素A蛋白、20ngml重组人白细胞因子蛋白、3μMCHIR99021；含有Y-27632的G1ER培养基的成分包含：体积百分比为50%的G-1TMPlus卵裂球培养基、25%的Essential8培养基和25%的RACL培养基；所述RACL培养基包含95%-98.5%的含有GlutaMAX的基础培养基RPMI1640、体积百分比为1%的B27添加剂、体积百分比为0.5%的青霉素-链霉素双抗、0.1 mM非必须氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇，100ngml重组人激活素A蛋白、20ngml重组人白细胞因子蛋白、3μMCHIR99021、10μMY-27632；步骤（2）所述G2EE培养基的成分包含：体积百分比为50%的G-2TMPlus胚胎培养基、25%的Essential8培养基和25%的EBB培养基；所述EBB培养基包含100%的Essential6培养基、20ngml重组人骨形态发生蛋白4、10ngml重组人成纤维细胞生长因子2；步骤（3）所述aG2EE培养基的成分包含：体积百分比为50%的G-2TMPlus胚胎培养基、25%的Essential8培养基和25%的aEBB培养基；所述aEBB培养基包含100%的Essential6培养基、100ngml重组人骨形态发生4蛋白、10ngml重组人成纤维细胞生长因子2；步骤（4）所述bG2EE培养基的成分包含：体积百分比为50%的G-2TMPlus胚胎培养基、25%的Essential8培养基和25%的bEBB培养基；所述bEBB培养基包含100%的Essential6培养基、75ngml重组人骨形态发生4蛋白、10ngml重组人成纤维细胞生长因子2。

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