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申请/专利权人：中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心)
摘要：本发明提供一种基于体外连接手段的拯救猪流行性腹泻病毒FJzz1株的反向遗传系统及其应用。通过对其全基因组进行分析，在其全基因组内特有的限制性内切酶酶切位点的基础上，我们将其分为A、B、C、D、E、F和G大小不等的七个片段。随后为提高后续连接效率，我们将这七个小片段整合为AB、CDE和FG三个大片段。利用T7体外转录试剂盒将全长cDNA体外转录为RNA转录本与N基因RNA转录本一起转染至Vero细胞拯救病毒。成功获得了可稳定遗传，且具有遗传标记的rFJzz1弱毒感染性克隆毒株，为后续研究FJzz1株PEDV致病机理和新型疫苗的研制提供了技术平台。
主权项：1.一种基于体外连接手段的拯救猪流行性腹泻病毒FJzz1株的反向遗传系统，其特征在于所述反向遗传系统包括：a改造的载体pBSK；bPEDV基因组全长片段；c包含猪流行性腹泻病毒N基因的辅助质粒；其中载体pBSK是将质粒pBluescriptIISK+中KpnI和SacI之间的多克隆位点区进行改造获得的，其中改造后的多克隆位点区顺序依次为KpnI-SacII-BamHI-AvrII-PacI-XmaI-BlpI-AgeI-AscI-SacI；PEDV基因组全长分为A、B、C、D、E、F和G大小不等的7个片段，这7个片段之间分别以BamHⅠ、AvrⅡ、PacⅠ、XmaI、BlpⅠ和AgeⅠ等6个特异性的限制性内切酶酶切位点相连；在A片段5’端增加T7原核启动子；在G片段3’端增加23个polyA尾巴；D片段和E片段之间的限制性内切酶酶切位点XmaI是通过沉默突变引入的一个遗传Maker；PEDV基因组全长7个片段整合为AB、CDE和FG三个大片段，在AB片段5’端增加一个T7原核启动子，用于后续的体外转录；同时为了提高拯救病毒的包装效率，在FG片段3’端增加一个由23个polyA组成的尾巴；其中，N基因的具体序列为Genbank号：MK288006.1，对应的具体位置26376-27701nt；扩增PEDV基因组的引物为：
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权利要求：
百度查询： 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 猪流行性腹泻病毒弱毒FJzz1株感染性克隆的构建与应用
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