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摘要：一种基于百合原生质体的瞬时转化的方法，属于生物技术领域。以百合组培苗叶片为材料，使用酶混合液酶解分离纯化原生质体，确定了最佳甘露醇浓度0.55‑0.77molL，最佳酶解时间6h，所得到的原生质体经纯化后，利用PEG‑Ca2+将外源基因高效转入百合原生质体进行瞬时表达的方法，确定最佳瞬时转化时间为24h。组培叶片只需一次取材，后期便可循环继代使用，操作简便且可常年进行。且该方法制备的原生质体产量大、活力高，利用百合原生质体为受体进行转化，绿色荧光蛋白GFP能成功表达，进一步解决了百合基因在其他植物异源表达的问题。

主权项：1.一种基于百合原生质体的瞬时转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：1将百合的无菌组培苗叶片切成1-2mm宽，进行预处理质壁分离，抽真空后放置，之后放入酶混合液的培养皿中进行酶解；2酶解完全后，将酶解液过滤，之后用W5洗液清洗，获得纯净的原生质体；3利用PEG-Ca2+介导百合原生质体瞬时转化，具体方法包括：将沉淀后的原生质体用MMG溶液重悬，使其浓度达到0.5-1×106个mL，取100μl的原生质体与10-15μg已构建好的瞬时表达载体混合，瞬时表达载体混合溶液与PEG-Ca2+溶液按比例1：1轻打混匀，在黑暗条件下诱导转化混合物，室温静置处理5-10min，室温下用混合溶液4倍的W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管，使之混合完全以终止转化反应；100×g离心2-5min，去上清，再用W5溶液清洗一次，去上清，用0.5-1ml的WI溶液轻轻重悬原生质体于多孔组织培养皿中，室温黑暗静置培养，转化后的原生质体暗处孵育24-36h后取出即可；WI溶液配制：0.66-0.77molL甘露醇；4mmolLMES;20mmolLKCl；pH5.7；121℃高压蒸汽灭菌20min；所述的百合为细叶百合或新铁炮百合；百合的无菌组培苗取21-30d的幼叶；所述的酶混合液包括1-2%纤维素酶；0.5-1.0%离析酶；0.1-0.15%果胶酶；0.20molLKH2PO4；1mmolLKNO3；10.07mmolLCaCl2.2H2O；1mmolLMgSO4.7H2O；0.96μmolLKI；0.1μmolLCuSO4.5H2O；5mmolLMES；0.55-0.77molL甘露醇；55℃水浴10min。

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百度查询： 沈阳农业大学 一种基于百合原生质体的瞬时转化的方法