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申请/专利权人：江南大学

摘要：本发明公开了一种弱化hemB基因表达提高大肠杆菌合成5‑氨基乙酰丙酸的方法，属于代谢工程和微生物发酵领域。本发明在使用载体pRSFDuet‑1过量表达谷氨酰‑tRNA还原酶，谷氨醛氨基转移酶和粪卟啉原III氧化酶以及使用载体pETDuet‑1过量表达尿卟啉原III合酶的基础上，通过在基因组水平改造hemB基因的启动子进而调控其表达，考察其对ALA积累的影响。通过摇瓶发酵验证，目的产物ALA产量有明显提高，30h时ALA产量为2680mgL。

主权项：一种提高大肠杆菌工程菌株产5‑氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，是在基因组水平削弱大肠杆菌工程菌株hemB基因的表达；所述在基因组水平削弱hemB基因的表达，是在基因组水平将hemB基因的启动子替换为在大肠杆菌生长稳定期强度减弱的启动子；所述在大肠杆菌生长稳定期强度减弱的启动子是fliC基因的启动子，来源于大肠杆菌，序列如SEQ ID NO.5所示。

全文数据：一种弱化hemB基因表达提高大肠杆菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法技术领域[0001]本发明涉及一种弱化hemB基因表达提高大肠杆菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，属于代谢工程和微生物发酵领域。背景技术[0002]5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinicacid，ALA，分子式为C5O3NH9,分子量为131.13,恪点为149-151°C，它是生物体合成叶绿素、血红素、维生素Bi2等关键前体物质。ALA已广泛应用于医学和农业领域，作为一种安全、选择、渗透性好的光动力学药物已成功应用于皮肤癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌等的诊断和光动力治疗中。另外，由于ALA在自然界中可降解，作为一种无公害的新型光活化农药、除草剂以及植物生长调节剂等在农药领域应用也非常广泛。[0003]目前，ALA主要通过化学法合成，最早出现在上世纪50年代，到20世纪90年代，相关研究开始大量开展并取得一定的成绩。但化学合成存在许多缺点，如反应步骤繁琐，副产物多，分离提纯困难，ALA得率也较低，并且环境污染严重。近年来，微生物发酵生产ALA已成为研究的热点。自然界中，ALA的生物合成存在两条途径，一条是C4途径，琥珀酰-CoA和甘氨酸在5-氨基乙酰丙酸合成酶ALAS，hemA编码作用下生成ALA的一步酶促反应，主要存在于一些光合细菌、真菌以及动物体内。另外一条是广泛存在于植物、藻类以及细菌如大肠杆菌）中的C5途径，首先谷氨酸在谷氨酰-tRNA合成酶GluRS，gltX编码催化下，生成谷氨酰-tRNA，然后，谷氨酰-tRNA在谷氨酰-tRNA还原酶GluTR，hemA编码作用下生成谷氨酸-1-半醛GSA，最后GSA由谷氨酸-1-半醛-2，1-氨基转移酶GSA-AT，hemL编码催化生成ALA。[0004]早期，人们筛选到产ALA的光合细菌类球红细菌Rhodobactersphaeroides，通过诱变育种筛选ALA的高产菌株，并通过发酵优化等方法使得ALA的产量达到7.2gL。但由于光合细菌的特殊性，其成本较高，不适合大规模的工业化生产。随着基因工程技术的成熟，Mariet和Zeikus选用大肠杆菌作为宿主细胞，采用基因工程的技术表达来源于R.sphaeroides的ALA合酶基因（hemA，ALA产量为3·7981^Χίθetal.等利用过量表达R.sphaeroides来源的hemA基因，经发酵优化，ALA产量最高达到5.2gL。但目前以C4途径为基础的生物转化由于添加前体琥泊酸和甘氨酸生产ALA成本相对较高，Kangetal.等通过分析大肠杆菌中C5途径的调控机制，发现ALA合成C5途径的关键基因hemA和hemL，同时实现了以葡萄糖为唯一碳源发酵生产ALA。[0005]由于ALA是血红素合成途径的关键前体物质（图1，而血红素是细胞生长所必需的，为了进一步促进ALA的积累，本发明在表达5-氨基乙酰丙酸C5合成途径关键酶基因hemL和hemA和表达来源于大肠杆菌血红素生物合成途径基因hemD及hemF的基础上，通过在基因组水平改造ALA下游5-氨基乙酰丙酸脱水酶编码基因hemB的启动子，弱化hemB基因的表达水平，实现ALA产量的进一步提高。发明内容[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种提高大肠杆菌工程菌株产5-氨基乙酰丙酸的方法，是在基因组水平削弱大肠杆菌工程菌株hemB基因的表达，实现ALA产量的进一步提尚。[0007]所述在基因组水平削弱hemB基因的表达，是在基因组水平将hemB基因的启动子替换为在大肠杆菌生长稳定期强度减弱的启动子，例如基因动子。[0008]在本发明的一种实施方式中，所述在大肠杆菌生长稳定期强度减弱的启动子是fliC基因的启动子，来源于大肠杆菌，序列如SEQIDNO.5所示。[0009]在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌株，是以大肠杆菌为宿主，使用不同拷贝数的表达载体组合过量表达谷氨酰-tRNA还原酶hemA编码）、谷氨醛氨基转移酶hemL编码）、尿卟啉原III合酶hemD编码和粪卟啉原III氧化酶hemF编码）。[0010]在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌是EscherichiacoliBL21DE3;所述不同拷贝数表达载体分别为pRSFDuet-Ι和pETDuet-Ι〇[0011]在本发明的一种实施方式中，所述hemL的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。[0012]在本发明的一种实施方式中，所述hemA的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。[0013]在本发明的一种实施方式中，所述hemD的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。[0014]在本发明的一种实施方式中，所述hemF的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。[0015]在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌株以pRSFDuet-Ι串联表达hemA、hemL、hemF，并以pETDuet_l表达hemD〇[0016]本发明还提供了一种5-氨基乙酰丙酸产量提高的重组大肠杆菌，是将大肠杆菌基因组中hemB基因的启动子替换为fIiC基因的启动子，并转入质粒pRSFDuet-1-hemA-hemL-hemF和pETDuet-1-hemD。[0017]所述重组大肠杆菌的构建方法，是通过基因重组将大肠杆菌基因组上的hemB基因的启动子替换为fIiC基因的启动子，然后将质粒pRSFDuet-1-hemA-hemL-hemF和pETDuet-Ι-hemD转化改造的菌株E.coliBL21DE3PfliC中，构建重组工程菌株PfliC-LADF-6:Ε·coliBL21DE3PfliCpRSFDuet-l-hemA-hemL-hemFpETDuet-l-hemD〇[0018]应用所述重组大肠杆菌生产5-氨基乙酰丙酸时，可将菌株活化后，以2%接种量转接发酵培养基中发酵，Oh时添加0.1-0.5mMIPTG诱导基因表达以及氨苄青霉素（100ygmL和卡那霉素50ygmL，30-37°C，200rmin培养，周期28-36h。[0019]本发明以表达C5途径关键基因hemL和hemA以及ALA代谢途径的下游基因hemD和hemF的工程菌为出发菌株，通过在基因组水平改造hemB基因的启动子，所得大肠杆菌工程菌株在3L发酵罐中积累5-氨基乙酰丙酸4.08gL，有效地利用C5途径促进5-氨基乙酰丙酸的合成，实现了ALA产量的进一步提高。附图说明[0020]图1:大肠杆菌中血红素合成途径。[0021]图2:基因组改造hemB启动子菌落PCR电泳图。M:DL5000Maker;A:对照；B:改造hemB启动子菌株;C:改造hemB启动子菌株。[0022]图3:改造hemB启动子对重组大肠杆菌合成ALA的影响。（a250mL摇瓶发酵结果;A:LADF-6;B:PfliC-LADF-6。⑹重组大肠杆菌在3L发酵罐发酵结果。具体实施方式[0023]ALA分析方法：[0024]采用Mauzerall和Granick的分光光度法:将样品稀释至2mL，加入ImL的乙酸钠缓冲液，0.5mL的乙酰丙酮，然后煮沸15min。冷却至室温，取2mL的反应液至新管中，然后加入2mL的ModifiedEhrlich’s试剂，反应20min，利用分光光度计554nm下检测。[0025]培养基：[0026]斜面培养基gL:蛋白胨10,氯化钠10,酵母粉5.0,琼脂20，pH7.0;[0027]种子培养基gL:蛋白胨10,氯化钠10,酵母粉5.0，pH7.0,装液量20mL250mL;[0028]发酵培养基（gL:NH42S〇4l5，KH2P〇45.0，Na2HP〇4·I2H2O15，MgS〇4·7H201.0，酵母提取物1.0,葡萄糖20,pH7.0。[0029]培养条件：[0030]菌种培养:甘油管划线，然后挑取单菌落划线平板37°C培养，作为种子来源；[0031]种子培养:平板挑取菌体，37°C，200rmin，根据要求添加氨苄青霉素100ygmL，卡那霉素50ygmL，培养约12h，转接发酵培养基；[0032]发酵培养：以2%接种量转接，Oh时添加0.1-0.5mMIPTG诱导基因表达，根据需要添加苄青霉素（l〇〇ygmL以及卡那霉素50ygmL，30-37°C，200rmin培养，周期28-36h。[0033]大肠杆菌工程菌LADF_6:E.coliBL21DE3pRSFDuet-l-hemLA-hemFpETDuet-1-hemD的构建方法，参见发明名称为“一种利用组合调控策略提高5-氨基乙酰丙酸产量的方法”，申请号为201410274656.2的专利申请。[0034]实施例1同源重组片段Pl-Kan-PfliC-P2的组装[0035]以大肠杆菌基因组为模板分别扩增hemB基因的启动子上游同源臂Pl934bp、下游同源臂P2726bp和fIiC启动子PfIiC130bp，以质粒pKD13为模板扩增筛选标记抗性基因Kan1330bp。然后以融合PCR的方法将4个片段组装，S卩Pl-Kan-PfliC-P23120bp。[0036]引物如下：[0037]上游同源臂Pl[0038]Fl：CACTTGTATCAAATGTCTCATTTGTGTG[0039]Rl：CGAAGCAGCTCCAGCCTACACTTATTTATAGCTGTTGGTTATTATTTTTTGG[0040]抗性基因Kan[0041]F2：TAACCAACAGCTATAAATAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG[0042]R2：TTTCAAAAACAGCCATTTTTTGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTAATT[0043]启动子PfIiC[0044]F3：TCATGTTTGACAGCTTATCAAAAAATGGCTGTTTTTGAAAAAAATT[0045]R3：CGTTGGATTAAGTCTGTCATGATTCGTTATCCTATATTGCAAGTC[0046]下游同源臂P2[0047]F4：GCAATATAGGATAACGAATCATGACAGACTTAATCCAACGCCC[0048]R4：AGTCTGCGCCCTGGGCTT[0049]实施例2hemB基因启动子改造[0050]启动子改造方法采用Red重组一步法敲除：[0051]1将质粒pKD46转化E.coliBL21DE3，该质粒为温度敏感型，菌体培养温度为30°C。挑取在斜面培养基中培养的单菌落接种于添加100mgL氨苄青霉素的SOB培养基中，30°C过夜培养约12h后，以2%接种量转接于添加100mgL氨苄青霉素的SOB培养基中继续培养至0D600nm约0.1-0.2时，添加终浓度IOmM的L-阿拉伯糖诱导重组酶的表达，继续培养至00600]11]1约0.6时，冰浴菌液约10111；[11。4°^，40001'111；[11离心10111；[11收集菌体，然后用无菌10%的甘油水溶液洗涤菌体三次，浓缩100倍，制备感受态细胞。[0052]2利用电穿孔仪，2500v，电击重组片段Pl-Kan-PfliC-P2,迅速加入600μϋΚ浴的SOC培养基，然后转入无菌的EP管中，30°C下后培养2h，然后涂布Kan抗性平板，30°C培养。挑取单克隆，利用菌落PCR验证（图2，与对照扩增片段大小为1830bp相比，改造启动子后扩增片段大小约为3000bp，说明启动子改造正确，进一步测序验证。[0053]3辅助质粒pKD46的消除，将改造正确的菌株在37°C下过夜培养，划线于LB平板上，待单菌落长出，分别在无氨苄抗性和含氨苄抗性的平板上点板，在无氨苄抗性的平板上生长而在含氨苄抗性的平板上不生长的菌，说明质粒已消除成功。[0054]4抗性基因的去除采用辅助质粒pCP20,将已成功消除质粒pKD46的菌株转化温度敏感型的质粒PCP20,挑取单菌落过夜培养后，按照1%vv的接种量转入装有20mLLB培养基的250mL的三角瓶中，30°C培养至0D600nm为0.1时，转入42°C条件下培养12h以上，然后将菌液划线无抗性的LB平板，挑取单克隆，分别在无抗性、含氨苄抗性和含卡纳抗性的LB平板上点板，以验证抗性基因和PCP20质粒是否成功去除。[0055]实施例3重组菌发酵验证[0056]菌株：[0057]LADF-6:E.coliBL21DE3pRSFDuet-l-hemLA-hemFpETDuet-l-hemD〇[0058]PfliC-LADF-6:E.coliBL21DE3PfliCpRSFDuet-l-hemLA-hemFpETDuet-1-hemD〇[0059]重组大肠杆菌PfliC-LADF-6与对照菌LADF-6分别在250mL三角瓶中发酵，接种量1%，初始葡萄糖浓度为20gL，Oh添加0.1-0.5mMIPTG诱导以及氨苄青霉素（100mgL和卡那霉素50mgL，IOh后ALA开始大量积累，在30h左右产量最高，为2680mgL，相比对照产量提高25%以上（图3a。[0060]将重组大肠杆菌PfIiC-LADF-6在3L发酵罐中放大培养，接种量2%，初始葡萄糖浓度约为35gL，Oh添加0·1-0·5mMIPTG诱导以及氨苄青霉素（100mgL和卡那霉素（50mgL，在30h左右产量最高，为4.08gL图3b。[0061]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

权利要求：1.一种提高大肠杆菌工程菌株产5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，是在基因组水平削弱大肠杆菌工程菌株hemB基因的表达;所述在基因组水平削弱hemB基因的表达，是在基因组水平将hemB基因的启动子替换为在大肠杆菌生长稳定期强度减弱的启动子;所述在大肠杆菌生长稳定期强度减弱的启动子是fliC基因的启动子，来源于大肠杆菌，序列如SEQIDNO.5所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌株，是以大肠杆菌为宿主，过量表达hemA编码的谷氨酰-tRNA还原酶、hemL编码的谷氨醛氨基转移酶、hemD编码编码的尿卟啉原III合酶和hemF编码的粪卟啉原III氧化酶。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌株以pRSFDuet-1串联表达hemA、hemL、hemF，并以pETDuet_l表达hemD〇4.一种5-氨基乙酰丙酸产量提高的重组大肠杆菌，其特征在于，是将大肠杆菌基因组中hemB基因的启动子替换为fliC基因的启动子，并以pRSFDuet-Ι串联表达hemA、hemL、hemF，并以pETDuet-1表达hemD;所述fliC基因的启动子来源于大肠杆菌，序列如SEQIDNO.5所示。5.—种构建权利要求4所述重组大肠杆菌的方法，其特征在于，是通过基因重组将大肠杆菌基因组上的hemB基因的启动子替换为fliC基因的启动子，然后以pRSFDuet-Ι串联表达hemA、hemL、hemF，并以pETDuet_l表达hemD〇6.权利要求4所述重组大肠杆菌在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用。

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