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申请/专利权人：北京大学口腔医学院

摘要：本发明提供了一种新的Wnt10afloxflox小鼠构建方法，以及鉴定筛选Wnt10afloxflox小鼠和Wnt10aflox+小鼠的PCR实验方法涉及的引物序列。本发明的Wnt10afloxflox小鼠构建方法用于构建Wnt10a基因的条件性敲除小鼠模型时，会敲除小鼠模型Wnt10a基因第二外显子，导致转录出来的转录本下游开放阅读框架移位，使其基因功能失活，达到基因敲除的实验效果。

主权项：1.一种Wnt10afloxflox小鼠的构建方法，其特征在于包括下述步骤：1利用基因打靶技术在小鼠胚胎干细胞的Wnt10a基因第二外显子序列两端插入loxp序列；2将步骤1所述的小鼠胚胎干细胞植入假孕母鼠的子宫内，生产出的嵌合体小鼠与野生小鼠交配，筛选出基因型为Wnt10aflox+的F1代小鼠；3选择所述步骤2筛选的基因型为Wnt10aflox+的F1代小鼠合笼交配，生产出F2代小鼠，筛选出基因型为Wnt10afloxflox的F2代小鼠。

全文数据：一种Wnt10afloxflox小鼠模型的构建方法技术领域本发明涉及制作转基因动物模型的领域，具体讲，涉及一种Wnt10afloxflox小鼠模型的构建方法及应用。背景技术人类WNT10A基因定位于2q35，含有4个外显子，可编码含有417个氨基酸的蛋白质。小鼠Wnt10a基因与人类WNT10A基因的相似性高达95%，这为利用小鼠模型研究人类WNT10A的功能奠定了极为有利的条件。Wnt10a作为Wnt家族中的重要配体成员，已被证实激活Wntβ-catenin经典信号通路。Wntβ-catenin信号通路在牙齿形成的各个阶段都十分活跃。在牙齿发育各个时期，牙源上皮和间充质中都可以检测到β-catenin的表达。尽管已有多篇文献报道Wntβ-catenin信号通路在牙齿发育过程中能够直接或间接地发挥调控作用，但关于Wnt10a在牙齿发育中的功能未完全阐明。为了更好的研究Wnt10a在小鼠牙齿发育中的功能，人们建立了小鼠模型。2014年，JieYang等人首次报道了Wnt10a全基因敲除（Wnt10a--）小鼠的表型，该研究报道中所能够的小鼠模型为全基因敲除Wnt10a小鼠，其技术手段为将Wnt10a基因全长进行剪切从而将其敲除，该种小鼠模型缺乏基因敲除的组织特异性，不利于研究Wnt10a基因在不同组织器官中发育过程中的作用及机制。发明内容为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种新的Wnt10afloxflox小鼠模型的构建方法。一种Wnt10afloxflox小鼠模型的构建方法，包括下述步骤：1利用基因打靶技术在小鼠胚胎干细胞的Wnt10a基因第二外显子序列两端插入loxp序列，包括构建载体、形成打靶载体和将打靶载体转入小鼠胚胎干细胞的步骤，所述构建载体还包括构建所述小鼠胚胎干细胞的Wnt10a基因条件性敲除载体的步骤：通过PCR扩增所述小鼠胚胎干细胞的Wnt10a基因同源臂及打靶区域，所述小鼠胚胎干细胞的Wnt10a基因同源臂两端带有与骨架同源的15bp碱基序列，酶切验证PCR产物，电泳检测PCR产物是否为特异性扩增，所述小鼠胚胎干细胞的Wnt10a基因的序列为SEQNO.1；2将步骤1所述的小鼠胚胎干细胞植入假孕母鼠的子宫内，生产出的嵌合体小鼠与野生小鼠交配，筛选出基因型为Wnt10aflox+的F1代小鼠，所述筛选出基因型为Wnt10aflox+的F1代小鼠的方法为PCR实验方法，用的引物序列为：SEQNO.2:TCACTGTCACTCGAGGCAASEQNO.3:TCTCTCTGACCCTAAGGAGC；3选择所述步骤2筛选出的基因型为Wnt10aflox+的F1代小鼠合笼交配，生产出F2代小鼠，筛选出基因型为Wnt10afloxflox的F2代小鼠；所述筛选出基因型为Wnt10afloxflox的F2代小鼠的方法为PCR实验方法，用的引物序列为：SEQNO.2:TCACTGTCACTCGAGGCAASEQNO.3:TCTCTCTGACCCTAAGGAGC。所述步骤2中将小鼠胚胎干细胞植入假孕母鼠的子宫内的具体步骤为利用显微注射技术将步骤1所述的小鼠胚胎干细胞注射到小鼠3.5天胚胎中，然后植入假孕母鼠的子宫内。本发明还提供了前述的Wnt10afloxflox小鼠模型的构建方法在构建小鼠胚胎干细胞的Wnt10a条件性基因敲除小鼠中的应用，具体为构建在牙根前体细胞、牙间充质细胞及牙上皮细胞中特异性敲除Wnt10a基因的条件性敲除小鼠中的应用，这些Wnt10a基因的条件性敲除小鼠模型可以用于揭示Wnt10a在磨牙牙根发育不同阶段的表达情况。本发明的有益效果在于：本发明提供了一种新的Wnt10afloxflox小鼠模型的构建方法，以及鉴定筛选Wnt10afloxflox小鼠和Wnt10aflox+小鼠的PCR实验方法涉及的引物序列。本发明的Wnt10afloxflox小鼠模型构建方法用于构建所述Wnt10a基因的条件性敲除小鼠模型时，会敲除小鼠模型Wnt10a基因第二外显子，导致转录出来的转录本下游开放阅读框架移位，使其基因功能失活，达到基因敲除的实验效果。附图说明图1为本发明Wnt10a基因条件性敲除载体的构建策略示意图；其中图1-a为野生型小鼠Wnt10a基因示例，图1-b为Wnt10aflox+的F1代小鼠基因示例，图1-cWnt10afloxflox的F2代小鼠基因示例；图1中标号1-4以及标号A代表：1：小鼠Wnt10a基因第一外显子；2：小鼠Wnt10a基因第二外显子；3：小鼠Wnt10a基因第三外显子；4：小鼠Wnt10a基因第四外显子；A：loxp序列。图2为Wnt10a基因条件性敲除简图。图3为F1代小鼠基因型鉴定结果图。图4为Wnt10afloxflox小鼠的繁殖过程示意图。图5为Wnt10afloxfloxF2代小鼠基因型鉴定结果图。实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1loxP序列插入位置的筛选以小鼠的Wnt10a的DNA序列为基础，在目标DNA序列的两端各放置一个loxP序列,得到floxflankedbyloxP小鼠。小鼠Wnt10a的序列如SEQNO.1。其中第一外显子的位置为1-265号碱基，第二外显子的位置为266-528号碱基，第三外显子位置为529-908号碱基，第四外显子位置为909-1962号碱基。loxP序列如下：SEQNO.4：ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT因为第一外显子中含有Wnt10a基因的启动子，在第一外显子两端位置插入loxP序列，可能会影响Wnt10a基因的启动子的表达，这不仅会导致Wnt10afloxflox小鼠的Wnt10a基因的失活，更会使得构建Wnt10a条件性基因敲除小鼠出现失败。通过对本项目多年的工作总结，发现由WNT10A基因突变导致的先天缺牙患者中，其突变位点多位于第三、四外显子。经过反复推导，研究人员认为不管是单独敲除外显子4或者外显子3，都会有前面编码序列仍然表达的危险，而导致模型小鼠无法表达出设定的Wnt10a蛋白缺陷，影响实验结果。若敲除Wnt10a基因的第三、四外显子，仍然可能存在前两个外显子所编码的区域表达的危险，导致构建的了Wnt10afloxflox小鼠制备的Wnt10a条件性基因敲除小鼠部分会表达不出设定的Wnt10a蛋白缺陷，影响实验结果。若敲除外显子2和3也可以达到基因敲除的目的，但该基因的内含子2太大（6.9kb）,flox的DNA片段太大会导致基因同源重组的效率下降，不易得到flox的细胞，增加实验筛选的难度。研究人员认为敲除第二个外显子，会导致转录出来的转录本下游开放阅读框架移位,下游的编码序列会提前产生一个终止密码子，这样作为真核细胞中重要RNA监控机制，无义介导的mRNA降解nonsense-mediatedmRNAdecay，NMD）能识别并降解这个缺失第二个外显子的mRNA，达到基因敲除的目的。因此，本发明将小鼠wnt10a基因的第二外显子作为条件性敲除的靶标片段，设计Wnt10afloxflox小鼠构建方案时，将loxp序列插在Wnt10a第二外显子的两端。实施例2一种Wnt10afloxflox小鼠模型的构建方法，包括下述步骤：（1）利用基因编辑技术在小鼠胚胎干细胞的Wnt10a基因第二外显子序列两端插入loxp序列；（2）将胚胎干细胞植入假孕母鼠的子宫内，生产出的F1代小鼠，筛选出基因型为Wnt10aflox+的F1代小鼠；（3）选择所述步骤（2）筛选的基因型为Wnt10aflox+的F1代小鼠合笼交配，生产出F2代小鼠，筛选出基因型为Wnt10afloxflox的F2代小鼠。实施例3小鼠胚胎干细胞的Wnt10a基因第二外显子序列两端插入loxP序列1、构建载体以BACDNA为模板扩增Wnt10a基因编码区域，对扩增产物进行测序鉴定后构建载体，具体步骤为：（1）构建小鼠Wnt10a基因条件性敲除载体：通过PCR扩增目的基因同源臂及打靶区域，同时两端带有与骨架同源的15bp碱基序列；（2）酶切验证PCR产物，电泳检测PCR产物是否为特异性扩增；2、形成打靶载体在载体的Wnt10a基因第二外显子序列两端插入loxp序列，形成打靶载体，具体步骤为：（1）基础骨架上含有：高拷贝复制子（用于质粒在大肠杆菌中复制）、AmpKana抗性（用于含有质粒的菌体生长）、Neocassette元件（用于基因打靶后的正向筛选）、HSV-TKcassette元件（用于随机插入的负筛选）、重组酶识别位点（Neo的两端为Frt，便于在F1代中去除Neo；loxp用于条件性基因敲出）、多克隆位点（用于插入同源臂和cKO片段）；（2）在目标外显子上下游300bp外设计PCR扩增引物，要求PCR扩增引物5端需携带与基础骨架15bp的重复序列，以便重组反应。5arm大小约为4.1kb，cKO大小约为1.4kb，3arm大小约为3.0kb;（3）用AvrIIAscI双酶切基础骨架,将3arm片段和骨架按照Clontech试剂盒说明书（cat.Nos.Many011614）进行连接。将菌检到的阳性克隆进行酶切验证和测序验证，正确克隆命名为Wnt10a-step1；（4）用BsiWIClaI双酶切Wnt10a-step1骨架,将cKO片段和骨架按照Clontech试剂盒说明书（cat.Nos.Many011614）进行连接。将菌检到的阳性克隆进行酶切验证和测序验证，正确克隆命名为Wnt10a-step2；（5）用NotISalI双酶切Wnt10a-step2骨架,将5arm片段和骨架按照Clontech试剂盒说明书（cat.Nos.Many011614）进行连接。将菌检到的阳性克隆进行酶切验证和测序验证，正确克隆命名为Wnt10a-step3。3、打靶载体电转入小鼠胚胎干细胞将构建成功的打靶载体电转入小鼠胚胎干细胞中，具体步骤如下：提前一周复苏细胞，扩增到足够的细胞数后，进行电转。电转前一天提前准备好电转后要接种的对应抗性MEF培养皿。电转当天看细胞状态，在细胞对数期时消化细胞，取一定的细胞数用相对应量的电转缓冲液进行悬浮，加入到EP管中，然后加入固定的质粒质量，放在冰上5分钟后，从EP中取出细胞质粒和电转缓冲液混合物，加入到电转杯中用电转仪进行电转，电转后放置冰上10分后接种到提前换好ES培养基的MEF皿中，24h后加入对应抗性浓度的药进行筛选。一周后挑选克隆，通过PCR筛选出正确打靶的克隆。实施例4Wnt10aflox+的F1代小鼠1、假孕母鼠构建1.1结扎公鼠制备挑选4-6周龄的雄性ICR小鼠进行输精管结扎手术，术后2周左右进行与6周龄以上雌性ICR小鼠合笼，可让雌鼠见栓且不能怀孕的雄鼠作为结扎公鼠备用。1.2发情鼠挑选从6周龄以上雌性ICR小鼠中挑选阴部红肿明显的自然发情母鼠作为预备假孕母鼠。1.3合笼和检栓将预备假孕母鼠与结扎公鼠合笼，次日上午9点前检栓，见阴道栓的母鼠作为代孕鼠备用。2、植入胚胎干细胞2.1ES细胞注射前的准备吸取20ulM2操作液，在塑料培养皿上做2个液滴，一个液滴在上放制预备注射的ES细胞，1个液滴在下放置提前准备好的待囊胚，加上矿物油至覆盖培养基液面。2.2ES细胞注射在倒置显微镜下仔细地选择状态良好的ES细胞吸入注射针内，然后将注射针扎入囊胚腔将ES细胞注入，撤出注射针并小心避免ES细胞流出。2.3带ES细胞的囊胚移植将注入ES细胞的囊胚用口吸管在解剖镜下移入事先麻醉好的代孕鼠子宫内，待小鼠苏醒后转移至动物房内饲养。3、基因型为Wnt10aflox+小鼠的鉴定和筛选3.1小鼠组织基因组DNA提取：1小鼠打耳标标记，剪取尾巴剪短3-5mm组织，放入1.5ml尖底Eppendorf离心管中。2向装有组织的1.5mlEppendorf离心管中加入75ul25mMNaOH、0.2mMEDTA裂解液。3将装有裂解液的1.5mlEppendorf离心管置于99℃热块中加热30min4晾至室温后，加入40mMTris-HCl中和。产物可直接用作基因型鉴定模板使用。3.2聚合酶链式反应（PCR）：反应体系：2×Taq聚合酶Mix或实时定量PCR专用2×Taq聚合酶Mix10μl;正向引物（TCACTGTCACTCGAGGCAA）10μM1μl;逆向引物（TCTCTCTGACCCTAAGGAGC）10μM1μl;cDNA模版1μl;无菌水8μl。反应条件：1）94℃2min预变性；2）94℃30sec，引物退火温度40sec，72℃30sec三步法40个循环；3）72℃7min后延伸。PCR扩增片段检测：配制1.2%琼脂糖凝胶及1×TAE电泳缓冲液，取PCR反应液5μl上样于1%琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，0.5μgmlGoldview染色10min，用GENESnap凝胶成像系统观察记录，PCR产物有558bp及425bp两条条带的样本可判定其基因型为Wnt10aflox+。图3为F1代小鼠基因型鉴定结果图。其中图3上1、2、3、4分别代表4只等待鉴定的F1代小鼠样本PCR产物、M代表DNAMarker，WT代表野生型对照组样本PCR产物。4只F1代小鼠的PCR产物都显示出558bp和425bp两个条带的样本，可判定这4只F1代小鼠其基因型都为Wnt10aflox+。实施例5基因型为Wnt10afloxflox的F2代小鼠基因型为Wnt10afloxflox的F2代小鼠鉴定1，小鼠组织基因组DNA提取：1小鼠打耳标标记，剪取尾巴剪短3-5mm组织，放入1.5ml尖底Eppendorf离心管中。2向装有组织的1.5mlEppendorf离心管中加入75ul25mMNaOH、0.2mMEDTA裂解液。3将装有裂解液的1.5mlEppendorf离心管置于99℃热块中加热30min4晾至室温后，加入40mMTris-HCl中和。产物可直接用作基因型鉴定模板使用。2，聚合酶链式反应（PCR）：反应体系：2×Taq聚合酶Mix或实时定量PCR专用2×Taq聚合酶Mix10μl;正向引物（TCACTGTCACTCGAGGCAA）10μM1μl;逆向引物（TCTCTCTGACCCTAAGGAGC）10μM1μl;cDNA模版1μl;无菌水8μl。反应条件：1）94℃2min预变性；2）94℃30sec，引物退火温度40sec，72℃30sec三步法40个循环；3）72℃7min后延伸。PCR扩增片段检测：配制1.2%琼脂糖凝胶及1×TAE电泳缓冲液，取PCR反应液5μl上样于1%琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，0.5μgmlGoldview染色10min，用GENESnap凝胶成像系统观察记录，PCR产物只有558bp一条条带的样本可判定其基因型为Wnt10afloxflox。图5为Wnt10afloxfloxF2代小鼠基因型鉴定结果图。其中图5上的1-7分别代表7只F2代小鼠样本PCR产物，8号为野生型对照小鼠。其中4号和7号样本PCR产物只有一条558bp大小的条带，判定4号和7号的F2代小鼠其基因型为Wnt10afloxflox；而1-3号和5-6号的F2代小鼠PCR产物皆有两条条带，判定1-3号和5-6号的F2代小鼠其基因型不是Wnt10afloxflox。所获得的基因型为Wnt10afloxflox的F2代小鼠：（1）全部通过基因型鉴定，Wnt10afloxfloxF2代小鼠为纯合子的基因型，子代均可用于实验；（2）该种小鼠的生育、生产、发育及生殖等基本现象正常，可用于体内对照实验；（3）该种小鼠的Wnt10a基因表达正常，可以用于Wnt10a基因功能监测的实验动物模型；（4）用本发明构建Wnt10afloxfloxF2代小鼠的方法应用在Wnt10a条件性基因敲除小鼠时，获得的Wnt10a条件性基因敲除小鼠可以按照设定目标表达出相应部位的Wnt10a基因表达缺陷的性能，例如构建在牙根前体细胞、牙间充质细胞及牙上皮细胞中特异性敲除Wnt10a基因的条件性敲除小鼠分别在牙根前体细胞、牙间充质细胞及牙上皮细胞中表现出Wnt10a基因表达缺陷的性状。序列表北京大学口腔医学院一种制备Wnt10afloxflox小鼠的方法及应用2018.9.164SIPOSequenceListing1.011977DNAmice1ggcgggcgccgtctgctgcgggagctgtgacctgagtaggagctgtgtgtcgcagccgcc60ccacccctgccgatcatgcgccggcgaccctggttcgccagtcccactgggctgtgagcc120ccccactcctggcctgtcacggcccgcgcgccatgggcagcgcccaccctcgcccctggc180tgcggctcccacaagggccccagccgcggcctgagttctgggcgctcctgttcttcctac240tgctgctggctgccgctgtgcccaggtcagcacccaacgacatcctgggcctccgcctac300ccccagagcccgtgctcaacgccaacacagtgtgcctgacattgcccggcctgagccggc360ggcagatggaggtgtgtgtgcgtcaccctgacgtggccgcctctgctatccagggcatcc420agatcgccatccatgagtgccagcatcagttccgggaccagcgctggaactgctccagcc480tggagactcggaacaaagtcccctacgagagccccatcttcagccgaggttttcgagaga540gtgctttcgcctacgccatagcagctgccggggtggtgcacgcagtgtccaacgcgtgcg600ctctgggtaaactgaaggcttgcggttgcgacgcctccagacgtggggacgaagaagctt660tccgtcggaagctgcaccgcttgcagctggacgcgctgcagcgcggaaagggcttgagcc720acggggtccctgaacacccggccatacttcctgccagcccaggtctgcaggactcctggg780agtggggtggctgcagtccggatgtgggcttcggagaacgcttctctaaggactttctgg840actcccgagagcctcacagagacatccatgctcgaatgagactccacaacaaccgtgtgg900gccggcaggcggtgatggagaacatgcggcgtaagtgcaaatgccacggcacctcaggca960gctgccagctcaagacctgctggcaggtgacgcctgagttccgcacagtaggggcgctgc1020tgcgcaaccgcttccaccgcgccacgctcatccggccgcacaaccgcaacggtggccagc1080tggagcccggccccgcgggagcaccctcgccagcaccgggcactccagggctgcgccgca1140gggccagccactccgacctggtctactttgagaaatctcccgacttctgtgagcgcgagc1200cgcgcctggactcggcaggcactgtgggccgcctgtgcaataagagcagcacgggtcccg1260atggctgcggcagcatgtgctgtggccgcggccacaacattctgcgccagacgcgcagcg1320agcgctgccactgccggttccactggtgctgcttcgtggtctgcgaagaatgccgcatca1380ccgagtgggtcagcgtctgcaagtgagcagacccaagctcctctgggtctcaagaatggt1440tgtcctcttggtgcctggcttctgccgctagcggatctgagccaggcagcaagcagcagc1500cttggctcctgagagaggtggttggctcttacagccccgagggtctacaatcaccagaca1560gtccagatctgattgacattcctccgctcacctctgtaggttcccctctttctgttccta1620gctcagacagctgggggtgatagtggagactgttccacaccctaggacaggtcaccaaag1680cagcccagcctggcatgcctacctcctgtcatctcttcttcccttccccaggagtgatag1740gcaatgcactgaagctgatgggcaccggggaagaaaactaaaaggcagaaatggccgtca1800tcgggctgaagtgactctaagggctccagacctctgctcctgtctttcacttaacagata1860tttatttttgcgctctctttgagacactctctggggaaaaagaagctccggagtctacag1920gctgattaagggacatggacaataaaccagtaaacacacaaaaaaaaaaaaaaaaaa1977219DNAhumandesign2tcactgtcactcgaggcaa19320DNAhumandesign3tctctctgaccctaaggagc20434DNAhumandesign4ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttat34

权利要求：1.一种Wnt10afloxflox小鼠模型的构建方法，其特征在于包括下述步骤：1利用基因打靶技术在小鼠胚胎干细胞的Wnt10a基因第二外显子序列两端插入loxp序列，包括构建载体、形成打靶载体和将打靶载体转入小鼠胚胎干细胞的步骤，所述构建载体还包括构建所述小鼠胚胎干细胞的Wnt10a基因条件性敲除载体的步骤：通过PCR扩增所述小鼠胚胎干细胞的Wnt10a基因同源臂及打靶区域，所述小鼠胚胎干细胞的Wnt10a基因同源臂两端带有与骨架同源的15bp碱基序列，酶切验证PCR产物，电泳检测PCR产物是否为特异性扩增，所述小鼠胚胎干细胞的Wnt10a基因的序列为SEQNO.1；2将步骤1所述的小鼠胚胎干细胞植入假孕母鼠的子宫内，生产出的嵌合体小鼠与野生小鼠交配，筛选出基因型为Wnt10aflox+的F1代小鼠，所述筛选出基因型为Wnt10aflox+的F1代小鼠的方法为PCR实验方法，用的引物序列为：SEQNO.2:TCACTGTCACTCGAGGCAASEQNO.3:TCTCTCTGACCCTAAGGAGC；3选择所述步骤2筛选出的基因型为Wnt10aflox+的F1代小鼠合笼交配，生产出F2代小鼠，筛选出基因型为Wnt10afloxflox的F2代小鼠；所述筛选出基因型为Wnt10afloxflox的F2代小鼠的方法为PCR实验方法，用的引物序列为：SEQNO.2:TCACTGTCACTCGAGGCAASEQNO.3:TCTCTCTGACCCTAAGGAGC。2.如权利要求1所述的Wnt10afloxflox小鼠模型的构建方法，其特征在于所述步骤2中将小鼠胚胎干细胞植入假孕母鼠的子宫内的具体步骤为利用显微注射技术将步骤1所述的小鼠胚胎干细胞注射到小鼠3.5天胚胎中，然后植入假孕母鼠的子宫内。

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