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申请/专利权人：深圳市儿童医院

摘要：本发明涉及一种Jurkat‑KI‑R5及其构建方法和应用，本发明将强有力的增强子启动子组合CAG通过CRISPRCas9基因编辑技术同源重组敲入到CD4+JurkatT细胞的CCR5基因的启动子区，基因修饰的细胞系命名为Jurkat‑KI‑R5细胞。本发明所述Jurkat‑KI‑R5细胞CAG启动子的精确重组到CCR5启动子指定位置，导致CCR5稳定地高表达。和母系Jurkat细胞相反，Jurkat‑KI‑R5细胞极易被HIV‑1感染。所以，Jurkat‑KI‑R5细胞提供了一个艾滋病研究急需的细胞平台。

主权项：1.一种Jurkat-KI-R5细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：得到培养中的Jurkat细胞；构建pU6-CCR5-gRNA载体：用BbsI限制性内切酶对pU6-gRNA载体进行酶切，回收；插入DNA双链，所述DNA双链由SEQIDNO.2和SEQIDNO.3经退火而成；经感受态细胞转化、提取质粒，得到pU6-CCR5-gRNA载体；构建修复模板DNA载体，该修复模板DNA载体5’端至3’端依次包括有CCR5基因上游同源臂，LoxP位点，CAG启动子，抗性筛选基因Puro-IRES-Neo，LoxP位点，CAG启动子，CCR5基因下游同源臂；将线性化的修复模板DNA载体、pU6-CCR5-gRNA质粒和能表达hCas9的质粒共转染进入Jurkat细胞中，转染后加入培养液令细胞恢复生长，随后加入含有嘌呤霉素的培养基中培养，筛选分离出单克隆，得到Jurkat-KI-R5细胞系；所述修复模板DNA载体的序列如SEQIDNO.4所示；所述能表达hCas9的质粒为pCAG-hCas9质粒。

全文数据：Jurkat-KI-R5细胞系及其构建方法和应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术，具体是涉及Jurkat-KI-R5细胞系及其构建方法和应用。背景技术[0002]尽管抗逆转录病毒疗法防治艾滋病毒在过去几十年的发展作出巨大努力，艾滋病仍然是全球最重要的传染病之一。根据联合国艾滋病规划署报告，2013年艾滋病全球流行，艾滋病毒携带者的预计数量从1990年的8.1百万上升到2012年的35.3百万。此外，药物抗性HIV病毒株最近已报道。因此，开发新的治疗方法用于清除病人体内的艾滋病病毒是十分重要的治疗手段。能无限增殖的HIV宿主细胞系对于艾滋病研究和治疗的发展是非常重要的。[0003]HIV主要以体内巨噬细胞和⑶4+T细胞为靶标。另外，CCR5和CXCR4辅助受体是HIV感染T细胞所必需的。因此，建立稳定表达HIV-I辅助受体CCR5的⑶4+T细胞将对HIV研究非常有用。然而，现有的细胞系要么低表达CCR5而不支持R5HIV-1感染，或者不能从随意整合到基因组中的转基因CCR5表达载体稳定表达CCR5。因此，HIV研究中的一个瓶颈问题是缺乏同时稳定表达⑶4及CCR5的T细胞系。即使先前建立的CCR5转基因T细胞系，因为表达载体随机整合到基因组中，而导致转基因的不稳定表达。所以，建立新的人类高表达内源性CCR5基因的CD4+T细胞系，对研发治疗HIV的新策略有重要作用。发明内容[0004]基于此，本发明的目的之一提供一种构建Jurkat-KI-R5细胞系的方法，构建得到的Jurkat-KI-R5细胞系可高水平表达CCR5。[0005]实现上述目的的技术方案如下。[0006]一种Jurkat-KI-R5细胞系的建立方法，包括以下步骤：[0007]A·培养Jurkat细胞；[0008]Β·构建pU6-CCR5-gRNA载体：用仙81限制性内切酶对?1]611?财载体进行酶切，回收；插入DNA双链，所述DNA双链由SEQIDNO.2和SEQIDNO.3经退火成，经感受态细胞转化、提取质粒，得到pU6-CCR5-gRNA载体；[0009]C.修复模板DNA载体的构建，该修复模板DNA载体5’端至3’端依次包括有CCR5基因上游同源臂，LoxP位点，CAG启动子，抗性筛选基因Puro-IRES-Neo，LoxP位点，CAG启动子，CCR5基因下游同源臂；[0010]D.将线性化的修复模板DNA载体、pU6-CCR5-gRNA质粒和能表达hCas9的质粒共转染进入Jurkat细胞，转染后加入培养液令细胞恢复生长，随后加入含有嘌呤霉素的培养基培养，筛选分离出单克隆，得到Jurkat-KI-R5细胞系。[0011]在其中一个实施例中，所述修复模板DNA载体的序列如SEQIDNO.4所示。[0012]在其中一个实施例中，电转染的参数为:0.4cm电击杯，250volt，975yF，细胞数量为5xl05-5xl06，DNA质量为1·8-2·2yg。[0013]在其中一个实施例中，所述能表达hCas9的质粒为pCAG_hCas9质粒。[0014]在其中一个实施例中，培养基中的嘌呤霉素浓度为1.5-2.Oygml。[0015]本发明的另一目的是提供一种Jurkat-KI-R5细胞系，其可用于研发艾滋病治疗药物的平台。[0016]实现上述目的的技术方案如下。[0017]根据上述构建方法得到的Jurkat-KI-R5细胞系。[0018]本发明的另一目的是提供上述Jurkat-KI_R5细胞系的应用。[0019]上述Jurkat-KI_R5细胞系在研发艾滋病治疗药物中的应用。[0020]上述Jurkat-KI-R5细胞系作为研发艾滋病治疗的平台的应用。[0021]为激活内源CCR5基因的表达，本发明将强有力的增强子启动子组合CAG通过CRISPRCas9基因编辑技术同源重组敲入到CD4+JurkatT细胞的CCR5基因的启动子区，基因修饰的细胞系命名为Jurkat-KI-R5细胞。流式细胞分析验证了CCR5在Jurkat-KI-R5T细胞表面的表达。Jurkat-KI-R5可否被HIV感染是通过检测HIV感染后的上清液P24的水平。[0022]本发明所述Jurkat-KI-R5细胞CAG启动子的精确重组到CCR5启动子指定位置，导致CCR5稳定地高表达，和母系Jurkat细胞相反，Jurkat-KI-R5细胞极易被HIV-I感染。所以，Jurkat-KI-R5细胞提供了一个艾滋病研究急需的细胞平台。以Jurkat-KI-R5细胞为系统，本发明建立了CRISPRCAS9介导的高效敲除CCR5基因的技术，为基因治疗艾滋病奠定了基础。附图说明[0023]图1为修复模板DNA载体的构建。[0024]图2为利用CRISPRCAS9技术，通过同源重组将CAG增强子启动子组合敲入Jurkat细胞内源性CCR5基因的启动子位点，其中，[0025]a人内源性CCR5基因位点的构型，黑框代表CCR5的外显子，两个同源臂Up-Arm和Dn-Arm如图所示，星号指定gRNA的革巴点；[0026]b同源重组后等位基因的构型；[0027]cCAG敲入克隆的PCR鉴定。引物a和b扩增1297bp的野生型片段，和引物A和B扩增重组后等位基因750bp的片段；[0028]dSouthernblotting验证等位基因的同源重组；[0029]eCCR5在CD4+Jurkat-KI-R5细胞表面高表达；[0030]fJurkat-KI-R5细胞支持HIV-I感染。具体实施方式[0031]为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。[0032]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售广品。[0033]实施例1:Jurkat-KI_R5细胞的建立[0034]1.1细胞培养[0035]Jurkat细胞ATCODNumber:TIB-152™培养密度维持在0.5-2xl06cellsmL，在基础培养基RPMI1640中加入10%热灭活的胎牛血清，lOOunitsml青霉素，100ygmL链霉素和2mmolL左旋谷酰胺进行培养。[0036]1.2DNA载体构建[0037]编码人源化Cas9蛋白的DNA载体购自Addgene货号：51142。产生靶向CCR5基因位点的gRNA的DNA载体pU6-CCR5-gRNA由pU6-gRNA质粒Addgene货号：53062通过连接相关靶向序列的退火DNA双链到两个BbsI酶切位点或其他11S型限制性内切酶（Type11S的质粒两侧分别有两个CCR5基因的同源臂，其中上游同源臂在CCR5基因的启动密码子ATG上游，下游同源臂包含CCR5基因的ATG及其下游，紧接着上游同源臂的是新霉素嘌呤霉素抗性筛选基因，该基因两侧存在LOXP位点，在抗性筛选基因后面的是用于过表达CCR5基因的CAG启动子。供体质粒通过DNA测序分析核实。具体构建步骤如下：[0038]1·2·lpU6-CCR5-gRNA载体的构建[0039]使用BbsI限制性内切酶对pU6-gRNA载体进行酶切，胶回收后用于下一步的载体与插入的DNA片段进行连接。插入的DNA片段由两条单链核苷酸经退火成DNA双链而成，该DNA片段包含靶向序列及与载体切口相连的相关序列，靶向序列为GTGCACAGGGTGGAACAAGASEQNO.2与SEQIDNO.3的斜体部分反向互补。根据试剂盒说明书进行，酶切胶回收后的载体与退火后的插入DNA片段在T7连接酶的作用下进行连接，经感受态细胞转化、小提质粒、酶切鉴定和DNA序列测序后确定正确的pU6-CCR5-gRNA载体用于下一步的细胞转染实验。具体如下：[0040]在IOul连接体系里，吸取5ul连接产物加入50ul冰上溶解的DH5Alpha感受态细胞，轻轻弹匀，冰上孵育30分钟，随后42°C水浴热激30-60s，热激后冰上孵育2-5分钟，随后加入950ul左右的LB培养基或者SOC培养基37°C复苏30-60分钟，均匀涂在带有氨苄西林的LB-Agar细菌培养板上。待长出细菌克隆后，挑选单克隆，根据质粒小提试剂盒的说明书进行小提。小提后取200ng质粒，用限制性内切酶NheI和No11包括但不限于这两种限制性内切酶，亦可使用其他任何可以鉴定该质粒的酶根据说明书进行切割，选取正确的质粒进行DNA测序，确定质粒插入了正确的序列。将正确的pU6-CCR5-gRNA载体用于下一步的细胞转染实验。[0041]1.2.2修复模板载体的构建[0042]修复模板DNA载体由常规分子克隆技术进行构建，具体序列如下:斜体部分的序列为CCR5基因上游同源臂，下划线部分的序列为LoxP位点，下划线加斜体部分的序列为CAG启动子，粗体部分的序列为抗性筛选基因Puro-IRES-Neo，阴影部分的序列为CCR5基因下游同源臂。其结构如图1所示。其完整序列本实施例优选如SEQIDNO.4。供体质粒通过使用Gibsonassembly方法构建以及序列分析核实。[0043]SEQIDNO.4:[0045]1.3Jurkat细胞转染及筛选[0046]应用Π型基因脉冲细胞电穿孔仪BioradGenePulserXcell共转染线性化的修复模板质粒4116-〇^5飞1?嫩质粒和?046-1^89质粒以1^6116公司，质粒编号51142。以及其他任何能表达hCas9的质粒，包括但不限于Addgene公司的其他质粒以及自己构建的能表达hCas9蛋白的质粒进入Jurkat细胞。电转染的具体参数为:0.4cm电击杯，250volt，975μF，细胞数量为1X106，DNA质量为2yg。转染后加入培养液令细胞恢复生长48小时，随后加入含有嘌呤霉素浓度为1.75ygml的培养基该培养基为常规培养Jurkat细胞的培养基，也可以为其他任何能培养Jurkat细胞的培养液培养14天。在嘌呤霉素筛选后存活的细胞中分离出单克隆，接种在96孔板，得到Jurkat-KI-R5细胞。[0047]实施例2:Jurkat-KI_R5细胞进行分析检测[0048]2.1流式细胞检测分析[0049]应用BDLSR-II流式细胞仪对Jurkat-KI-R5细胞进行表面人类CCR5和CD4蛋白的表达分析。数据通过FACSDivaBectonDickinson公司）和FlowJo软件进一步分析。IxlO6细胞使用PBS洗涤，室温下，使用DAPI，APCanti-hCCR5BD抗体和PEanti-CD4BD抗体染色30分钟。染色后将细胞用PBS洗涤两次，并重新悬浮于FACS缓冲液，然后上机分析。[0050]参加图2中的（eCCR5在CD4+Jurkat-KI-R5细胞表面高表达。[0051]由图2e可以看出，左图APC通道的Jurkat-KI-R5CCR5峰右移，而右图PE通道的CD4整体则无明显偏移。结果表明与野生型Jurkat细胞相比，Jurkat-KI-R5的细胞表面CCR5表达显著升高。[0052]2.2PCR检测[0053]应用PCR技术鉴定同源重组后的基因敲入细胞系Jurkat-KI-R5。正向引物5’_tctatgaccttccctgggactt-3’，SEQIDNO.5WPj5^3|f0d5’-cttgttccaccctgtgcataa_3’，SEQIDN0.6用于确定野生型等位基因在靶向基因上游的位点。正向引物A5’-tttcgacaccgaagcagagt-3’，SEQIDNO·7和反向引物D5’-gtgcatgttctttgtgggct-3’，SEQIDNO.8用于鉴定靶向基因的下游部分。关于同源重组后的基因敲入目标细胞系的PCR鉴定，使用与野生型鉴定中相同的正向引物，另外再设计相关的反向引物。反向引物b5’-tcgaacgtaaactcctcttcagac-3’SEQIDNO.9用于验证同源重组后的上游臂，而反向引物B5’-cgtgctggttattgtgctgtc-3’SEQIDNO·10用于鉴定同源重组后的下游臂。参见图2中的b，图中展示了探针的位置和SacI限制性片段的大小。PCR引物a，d，A和D被用来确定野生型等位基因。引物a，b，A和B用于筛选敲入的等位基因;PCR扩增子的大小如图所示。PCR扩增程序为：1.94°C4分钟；2.94°C45秒；3.57°C30秒;4.72°C45秒重复至第2步39个循环;5.72°C5分钟;6.维持4°C。[0054]CAG敲入克隆的PCR鉴定。[0055]扩增结果请参见图2中的（c，引物A和B扩增1297bp的野生型片段，和引物A和B扩增重组后等位基因750bp的片段。[0056]图2c左上图使用的引物是a+b，根据图2b中引物位置图可以知道只有Jurkat-KI-R5能扩增出1297bp的上游臂敲入等位基因。图2c右上图使用的引物是a+d，由图2a可以知道含有野生型等位基因的细胞均能扩增出l〇72bp的野生型片段。图2c左下图使用的引物是A+B，根据图2b中引物位置图可以知道只有Jurkat-KI-R5能扩增出750bp的下游臂敲入等位基因。图2c右下图使用的引物是A+D，由图2a可以知道含有野生型等位基因的细胞均能扩增出1368bp的野生型片段。综上所述，Jurkat-KI-R5属于杂合子型敲入细胞，一个等位基因为敲入型，另一个等位基因为野生型。[0057]2.3Southernblotting法分析[0058]分别提取野生型Jurkat细胞和基因重组后的Jurkat-KI-R5细胞的基因组DNA，各取DNA样品中的15yg用限制性内切酶SacI消化。消化后的DNA用1.0%琼脂糖凝胶分离，分离条件为:30-35V，160mA，16小时。然后通过毛细管吸收作用转膜，转移分离后的DNA片段至硝酸纤维素膜上，用32P标记的DNA探针去标记CCR5基因，验证基因是否准确敲入。参见图2中的d，Jurkat-KI-R5同时含有野生型WT和敲入型KI特异性条带，表明基因已经敲入到其中一个等位基因，与图2c中的PCR扩增结果一致，Jurkat-KI-R5为杂合子型敲入细胞。[006112.4艾滋病毒感染检测[0062]使用0.3M0IBaLHIV-I感染野生型Jurkat细胞和Jurkat-CCR5细胞2小时。阳性对照为使用同样方法感染的M0LT-4细胞，阴性对照为未被感染的M0LT-4细胞。在感染后第3天和第7天收集上清液，并测试P24的浓度水平。所有的测试均重复三次。数据统计分析是由Prism6程序处理。参见图2中的（f。在HIV-I感染的第三天，阴性对照M0LT4-novirus没检测到p24，阳性对照M0LT4-virus检测到高浓度的p24，表明实验设计合理，同时，野生型Jurkat也未检测到p24,Jurkat-KI-R5的p24浓度水平与阳性对照相当，与野生型Jurkat有显著性差异P=〇.0002;在HIV-I感染的第七天，阴性对照M0LT4-novirus没检测到p24，阳性对照M0LT4-virus检测到高浓度的p24,表明实验设计合理，同时，野生型Jurkat也未检测到p24，Jurkat-KI-R5的p24浓度水平与阳性对照相当，与野生型Jurkat有显著性差异p=0.0001;结果表明HIV-I只感染Jurkat-KI-R5细胞，不能感染野生型Jurkat细胞。[0063]以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。[0064]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

权利要求：1.一种Jurkat-KI-R5细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A.得到培养中的Jurkat细胞；8.构建口1]6-〇^511?祖载体：用仙81限制性内切酶对?1]611?嫩载体进行酶切，回收;插入DNA双链，所述DNA双链由SEQIDNO.2和SEQIDNO.3经退火而成；经感受态细胞转化、提取质粒，得到pU6-CCR5-gRNA载体；C.构建修复模板DNA载体，该修复模板DNA载体5’端至3’端依次包括有CCR5基因上游同源臂，LoxP位点，CAG启动子，抗性筛选基因Puro-IRES-Neo，LoxP位点，CAG启动子，CCR5基因下游同源臂；D.将线性化的修复模板DNA载体、pU6-CCR5-gRNA质粒和能表达hCas9的质粒共转染进入Jurkat细胞中，转染后加入培养液令细胞恢复生长，随后加入含有嘌呤霉素的培养基中培养，筛选分离出单克隆，得到Jurkat-KI-R5细胞系。2.根据权利要求1所述的Jurkat-KI-R5细胞系的构建方法，其特征在于，所述修复模板DNA载体的序列如SEQIDNO.4所示。3.根据权利要求1所述的Jurkat-KI-R5细胞系的构建方法，其特征在于，培养基中的嘌呤霉素浓度为1.5-2.Oygml。4.根据权利要求1所述的Jurkat-KI-R5细胞系的构建方法，其特征在于，电转染的参数为:O·4cm电击杯，250volt，975yF，细胞数量为5xl05-5xl06，DNA质量为1·8-2·2yg。5.根据权利要求1-4任一项所述的Jurkat-KI-R5细胞系的构建方法，其特征在于，所述能表达hCas9的质粒为pCAG_hCas9质粒。6.根据权利要求1-5任一项所述构建方法得到的Jurkat-KI-R5细胞系。7.权利要求6所述Jurkat-KI-R5细胞系在研发艾滋病治疗药物中的应用。8.权利要求6所述Jurkat-KI-R5细胞系作为研发艾滋病治疗的平台的应用。

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