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申请/专利权人：中国科学院合肥物质科学研究院

摘要：化学‑酶偶联制备R‑+‑2‑4‑羟基苯氧基丙酸的方法，本发明综合化学法与生物酶法优势，扬长补短，构建化学‑酶偶联生产技术体系：首先以廉价L‑丙氨酸为初始原料，以安全低毒苯酚代替危险高毒对苯二酚，常温常压制备R‑2‑苯氧基丙酸（D‑PPA），为生物酶提供高光学纯、低成本前体；其次，通过球孢白僵菌D‑PPA适应性进化，经全细胞生物催化和底物饲喂发酵，制备D‑HPPA；最后，收集残余菌体和孢子经干燥粉碎制备生防产品，实现资源化利用。项目从D‑HPPA合成技术路线创新入手，既减少了有毒有害试剂的使用，又提高了产品光学纯度，降低了生产操作难度和设备要求，实现高效绿色、安全节能生产，对我市农化企业提质增效、破除国外技术垄断与封锁具有重要意义。

主权项：1.一种化学-酶偶联制备R-+-2-4-羟基苯氧基丙酸的方法，其特征在于：包括下列步骤：步骤1：从L-丙氨酸通过重氮化和氯化反应合成S-2-氯丙酸将L-丙氨酸和盐酸溶液加入一反应容器中，然后将KCl加入，搅拌，当溶液自然冷却到0-2℃时，向反应混合物中加入NaNO2溶液；在此过程中，溶液逐渐变成黄色，并产生黄褐色气体；加完后，在0-2℃下继续搅拌；将反应溶液升温至室温；然后分批加入NaCO3，再搅拌；在NaCO3和反应体系中存在的过量酸之间反应形成的CO2气体将破坏氮氧化物和反应结果的结合，导致氮氧化物从反应体系中排出；反应结束后，每次用乙酸乙酯对混合物进行多次萃取；将有机层收集起来，用蒸发、冷凝后得到S-2-氯丙酸溶液；步骤2：从S-2-氯丙酸和苯酚通过醚化反应合成R-PPA将苯酚和NaOH溶液加入一反应器中；在室温下搅拌；然后依次加入步骤1制得的制备的S-2-氯丙酸溶液、NaOH溶液和KI；反应体系在120-130℃下加热至回流，搅拌；之后用HCl酸化至pH为3.8-4.2，沉淀出黄色油状物，随后用乙酸乙酯对混合物进行多次萃取，所有的有机层合并在一起并旋转蒸发；得到一种黄色粘稠的液体；用NaOH调节到pH值8.0-9.0，然后在15毫米×200毫米的玻璃柱上分离纯化，该柱由阴离子交换树脂AmberliteIRA-400法包覆；吸附在树脂上的R-PPA被HCl溶液洗脱；收集40-100毫升间隔的流出物，即为R-PPA；步骤2：球孢白僵菌的初始转化将球孢白僵菌接种于固体斜面活化培养基中，然后在28-32℃条件下，培养65-78h；用接种环挑取固体活化培养基中的球孢白僵菌单菌落转接于液体基础培养基中，然后再将液体基础培养基放置于恒温摇床中培养；待溶液中孢子数目达到107-108个mL个后取出球孢白僵菌菌液备用；在无菌环境下取50mL已活化扩繁的球孢白僵菌菌液，离心去掉上清液，留下菌体沉淀；然后用0.9%生理盐水将菌体沉淀进行重悬，于同样的离心条件下离心并去掉上清液，留下菌体沉淀；重复上述操作3-4次，尽可能洗掉菌体活化扩繁时的残留成分；将最后一次离心得到的菌体沉淀，用提前配好灭菌的磷酸盐缓冲液重新悬浮菌体，并重新定容至50mL；取45mL菌体磷酸盐悬浮液与5mL底物R-PPA溶液混合，将混合后的液体置于恒温摇床中进行生物转化；转化结束后，过滤出菌种，用10%HCl溶液酸化至pH值为6.5～7，反应液用异丙醚萃取，有机相弃之，水相用36%HCl溶液酸化至pH值大于2，析出白色固体，过滤，得粗品；重结晶:粗品溶于甲醇130mL，加入12g活性碳，回流搅拌30min，趁热过滤，减压浓缩溶剂，真空干燥，得到白色固体R-+-2-4-羟基苯氧基丙酸。

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