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申请/专利权人：中国水产科学研究院南海水产研究所

摘要：本发明公开了一种利用特定引物组鉴别鸢乌贼中型群和微型群的方法，所述特定引物组由一条正向引物MS700F和两条反向引物M800R、MS400R组成，所述正向引物MS700F的碱基序列如SEQNO.1所示，所述反向引物M800R及所述反向引物MS400R碱基序列分别如SEQNO.2和SEQNO.3所示，利用特定引物组PCR扩增鸢乌贼中型群和微型群的基因组DNA并电泳检测，电泳谱图显示：鸢乌贼微型群的PCR扩增产物仅在近400bp处出现一条特异亮带，鸢乌贼中型群的PCR扩增产物在近400bp和近800bp处各出现一条特异亮带，从而准确、快捷的区分两种鸢乌贼。

主权项：1.一种利用特定引物组鉴别鸢乌贼中型群和微型群的方法，其特征在于：所述特定引物组由一条正向引物MS700F和两条反向引物M800R、MS400R组成，所述正向引物MS700F的碱基序列如SEQNO.1所示，所述反向引物M800R的碱基序列如SEQNO.2所示，所述反向引物MS400R的碱基序列分别如SEQNO.3所示。

全文数据：一种利用特定扩増引物组鉴别鸢乌贼中型群和微型群的方法技术领域[0001]本发明涉及分子标记鉴别领域，具体涉及一种利用特定扩增引物组鉴别鸢乌贼中型群和微型群的方法。背景技术[0002]鸾乌贼（Sthenoteuthisoualaniensis俗称红就鱼，隶属枪形目（Teuthoidea、柔鱼科Ommastrephidae、鳶乌贼属（Sthenoteuthis，体表具小型近圆形色素斑，胴背，头部及触腕中央呈紫褐色，胴背前方皮下具卵圆形发光组织，雄性左侧第4腕茎化。鸢乌贼属于暖水性的大洋性种类，广泛分布于印度洋、太平洋的热带和亚热带海域，其中在南海和印度洋西北部海域鸢乌贼数量最为丰富，是我国南海大洋性渔业资源中最具开发潜力的种类。南海鸢乌贼根据形态特征可分为两种表型群，中型群和微型群。微型种群早熟且无背发光器，胴长范围9.8〜12cm;中型种群具背发光器，胴长范围12〜24cm。但幼体阶段的中型群与微型群外部形态相似，难以通过外部形态进行区分。[0003]分子遗传标记可快速、高效和灵敏地检测出基因组DNA的多态性，是当前用于分析水产生物种质鉴别与群体遗传特性的主要标记。利用电泳图谱分析技术，以条带的扩增情况来反映物种的特异遗传信息，操作方法简单、结果分析方便。有鉴于此，本发明人研宄和设计了一种利用特定扩增引物组鉴别鸢乌贼中型群和微型群的方法，本案由此产生。发明内容[0004]针对无法通过外部形态区分幼体阶段的中型群与微型群，本发明的目的在于提供一种特定扩增引物组并利用该特定引物组通过PCR扩增途径鉴别鸢乌贼中型群和微型群的方法。[0005]为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：一种利用特定引物组鉴别鸢乌贼中型群和微型群的方法，所述特定引物组由一条正向引物MS700F和两条反向引物M800R、MS400R组成，所述正向引物MS700F的碱基序列如SEQN0•1所示，所述反向引物M800R及所述反向引物MS400R碱基序列分别如SEQN0.2和SEQN0.3所示。[0006]一种利用特定引物组鉴别鸢乌贼中型群和微型群的方法，包括以下步骤：（1利用鸢乌贼中型群或微型群制备样本DNA;2对包含有样本DNA和特定引物组的PCR扩增体系进行PCR扩增〆3电泳检测PCR扩增后的扩增产物，利用凝胶成像系统拍照、记录，对电泳结果判定。[0007]优选地，通过以下方法判定电泳结果:PCR扩增产物只在近400bp处出现一条特异亮带的为鸢乌贼微型群，PCR扩增产物分别在近400bp和近800bp处各出现一条特异亮带的为鸢乌贼中型群。[000S]优选地，所述PCR扩增体系：扩增反应总体积为30ul，包括：3uL10XbufferMg2+plus，dNTPMixture各2.5mM，引物各0.5yM，0.5UTaq酶（TaKaRa和3uL模板DNA。[0009]优选地，所述PCR扩增的反应条件为:95°c预变性1min,94°c变性40s，48°C退火40s,72°C延伸1min，共35个循环;72°C3min充分延伸4°C结束。[0010]优选地，所述电泳的检测条件为:琼脂糖凝胶的质量浓度为2%、电泳电压120V、电泳时间30min。[0011]优选地，所述样本DNA采用海洋动物基因组DNA提取试剂盒TIANGEN从鸢乌贼中型群或微型群的20〜50mg的背部肌肉中提取的基因组DNA溶于100ml双蒸水中制得。[0012]本发明具有以下有益效果:本发明设计特定引物组对鸢乌贼中型群或微型群的样本DNA进行PCR扩增并电泳检测，利用电泳谱图中出现的明显差异可准确的区分幼体鸢乌贼中型群和微型群，也可以准确鉴别成年鸢乌贼中型群和微型群，具有准确、灵敏、操作简单、快速、高效的优点。附图说明[0013]图1为本发明鸢乌贼中型群和微型群的基因组DNA经特定引物组PCR扩增的PCR扩增产物的电泳图谱;其中，图中鸢乌贼中型群的PCR扩增产物在近400bp和近800bp处各出现一条特异亮带，鸢乌贼微型群的PCR扩增产物在近400bp处出现一条特异亮带。具体实施方式[0014]下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。[0015]本发明中所采用的原料如无特别说明均可从市场上购得或是本领域常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。[0016]实施例1一种利用特定引物组鉴别鸢乌贼中型群和微型群的方法，所述特定引物组由一条正向引物MS700F和两条反向引物M800R、MS400R组成，对应的碱基序列分别为：MS700F:5’-TGACTATTTTCTACAAACCAT-3’；M800R:5’-CTACAGTGAACATGTGATGAG-3’；MS400R:5’-AACTGATGGTCCAGCAT-3’。[0017]实施例2一种利用特定引物组鉴别鸢乌贼中型群和微型群的方法，包括以下步骤：1利用鸢乌贼中型群或微型群制备样本DNA;优选地，所述样本DNA采用海洋动物基因组DNA提取试剂盒TIANGEN从鸢乌贼中型群或微型群的20〜50mg的背部肌肉中提取的基因组DNA溶于1〇〇ml双蒸水中制得。[0018]2对包含有样本DNA和特定引物组的PCR扩增体系进行PCR扩增;优选地，所述PCR扩增体系:扩增反应总体积为30ul，包括:3uL10XbufferMg2+plus，dNTPMixture各2.5mM，引物各0.5福，0.5UTaq酶TaKaRa和3此模板DNA;优选地，所述PCR扩增的反应条件为:95°C预变性1min，94°C变性40s，48°C退火40s，72°C延伸1min，共35个循环;72°C3min充分延伸4°C结束。[0019]3电泳检测PCR扩增后的扩增产物，利用凝胶成像系统拍照、记录，对电泳结果判定;优选地，所述电泳的检测条件为:琼脂糖凝胶的质量浓度为2%、电泳电压120V、电泳时间30min〇对电泳结果的判定依据如下：如图i所示，当pcR扩增产物只在近4〇〇如处出现一条特异亮带的为鸢乌贼微型群，当PCR扩增产物分别在近4〇〇bp和近800bp处各出现一条特异亮带的为鸢乌贼中型群。[0021]本发明利用特定引物组扩增鸢乌贼中型群或微型群的基因组DNA，并在凝胶电泳检测结果中显示出清晰的条带差异，可准确地将幼体鸢乌贼中型群或微型群区分开，是一种有效且简便易行的鉴别手段。[0022]以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

权利要求：1.一种利用特定引物组鉴别鸢乌贼中型群和微型群的方法，其特征在于:所述特定引物组由一条正向引物MS700F和两条反向引物M800R、MS400R组成，所述正向引物MS700F的碱基序列如SEQNO.1所示，所述反向引物M800R及所述反向引物MS400R碱基序列分别如SEQNO.2和SEQNO.3所示。2.如权利要求1所述的一种利用特定引物组鉴别鸢乌贼中型群和微型群的方法，其特征在于:包括以下步骤：（1利用鸢乌贼中型群或微型群制备样本DNA;2对包含有样本DNA和特定引物组的PCR扩增体系进行PCR扩增；⑶电泳检测PCR扩增后的扩增产物，利用凝胶成像系统拍照、记录，对电泳结果判定。3.如权利要求2所述的一种利用特定引物组鉴别鸢乌贼中型群和微型群的方法，其特征在于:通过以下方法判定电泳结果:PCR扩增产物只在近400bp处出现一条特异亮带的为鸢乌贼微型群，PCR扩增产物分别在近4〇Obp和近8〇Obp处各出现一条特异亮带的为鸢乌贼中型群。4.如权利要求2所述的一种利用特定引物组鉴别鸢乌贼中型群和微型群的方法，其特征在于:所述PCR扩增体系:扩增反应总体积为30yl，包括:3yL10XbufferMg2+plus，dNTPMixture各2.5mM，引物各0_f5yM，0_5UTaq酶和3此模板DNA。5.如权利要求2所述的一种利用特定引物组鉴别鸢乌贼中型群和微型群的方法，其特征在于:所述PCR扩增的反应条件为:95°C预变性1min，94°C变性40s，48。：退火40s，72。:延伸1min，共35个循环;72°C3min充分延伸4°C结束。’6.如权利要求2所述的一种利用特定引物组鉴别鸢乌贼中型群和微型群的方法，其特征在于:所述电泳的检测条件为:琼脂糖凝胶的质量浓度为2%、电泳电压120V、电泳时间30min〇7.如权利要求2所述的一种利用特定引物组鉴别鸢乌贼中型群和微型群的方法，其特征在于:所述样本DNA采用海洋动物基因组DNA提取试剂盒从鸢乌贼中型群或微型群的^〜50mg的背部肌肉中提取的基因组DNA溶于100ml双蒸水中制得。

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