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申请/专利权人：华中农业大学
摘要：本发明公开了一种在草鱼中双gRNA位点敲除runx2b基因的方法及应用，该方法设计靶位点gRNA‑1序列和靶位点gRNA‑2序列；体外转录并纯化分别获得gRNA‑1和gRNA‑2；再以pT3TS‑nCas9n线性化质粒为模板，体外转录合成Cas9mRNA；将gRNA‑1、gRNA‑2和Cas9mRNA混合显微注射到草鱼1细胞期的受精卵中；培育草鱼至三个月时，筛选出有突变的草鱼培育成亲本F0代；继续繁殖培育得到突变品系。该方法简单易行，操作简单，获得草鱼基因突变品系，具有开展水产生物基因功能研究，揭示其遗传发育规律，发掘和利用遗传资源培育高产、抗病抗逆品种等重要的科学意义。
主权项：1.一种在草鱼中双gRNA位点敲除runx2b基因的方法，其特征在于：包括以下步骤：1根据CRISPRCas9敲除原理，针对runx2b基因的第三外显子和第五外显子分别设计靶位点gRNA-1序列和靶位点gRNA-2序列；2以保守的下游Scaffold引物与带有T7启动子的特异性包含靶位点gRNA-1序列靶位点gRNA-2序列的上游引物进行overlapPCR扩增并纯化；以上述纯化后的PCR产物为模板，体外转录并纯化分别获得gRNA-1和gRNA-2；3以pT3TS-nCas9n线性化质粒为模板，体外转录合成Cas9mRNA；4将gRNA-1、gRNA-2和Cas9mRNA混合显微注射到草鱼1细胞期的受精卵中；5培育草鱼至三个月时，剪草鱼的尾鳍提取DNA，筛选出有突变的草鱼培育成亲本F0代；继续繁殖培育到多代获得缺失runx2b的纯合子，才是稳定的突变品系。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 华中农业大学 一种在草鱼中双gRNA位点敲除runx2b基因的方法及应用
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