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申请/专利权人：梅泰克斯营养学研究所有限责任公司

摘要：提供了一种不含苯丙氨酸的重组膳食蛋白质，它是一种具有高生物学价值的膳食蛋白质。还提供了编码所述膳食蛋白质的载体、表达所述蛋白质的微生物、所述蛋白质的生产方法以及包含所述蛋白质的膳食组合物，在一个实施方案中，所述膳食组合物在体内积聚苯丙氨酸的患者中被用作特殊医学目的的药物和或食物。

主权项：1.重组膳食蛋白质，其由多肽组成，所述多肽由SEQIDNO2的氨基酸序列组成。

全文数据：用于治疗PKU的无苯丙氨酸的蛋白质技术领域本发明涉及重组膳食蛋白质或其膳食充足部分，其中所述蛋白质不包含苯丙氨酸，该蛋白质用于患有苯丙酮尿症的患者的膳食。背景技术苯丙酮尿症PKUOMIM261600，ORPHA716是一种遗传性代谢疾病，在欧洲的发病率为1：10,000。在大多数情况下，这是由肝酶苯丙氨酸羟化酶PAH的功能缺失或受损引起的氨基酸代谢紊乱。PAH的缺乏反过来导致脑和血浆中过量的苯丙氨酸Phe。PAH的缺乏最终表现为缺乏酪氨酸，酪氨酸是神经递质的前体。与涉及蝶呤代谢的酶的突变一起，PKU与高苯丙氨酸血症HPA相关。由于血液Phe水平升高，大多数国家通常会在出生后的新生儿筛查期间诊断出该疾病。如果在生命早期未被发现和未经治疗，PKU会导致婴儿神经系统不可逆转的损害、严重的智力迟钝和大脑发育不良。未经治疗的患者除智力障碍外的其他特征包括神经系统并发症、神经心理受损以及执行功能缺陷。据报道，如果不及时治疗，婴儿在出生后的第一年就会损失智商。根据治疗开始时的年龄，不同年龄期间的血液Phe水平和膳食治疗PKU的依从性不可避免地会伴随着至少一些智商的丧失。一旦检测到，通过向婴儿和之后的儿童提供Phe限制膳食来治疗该病症。在成人中，典型PKU患者常规服用的蛋白质补充剂是无Phe的，假设这样的成年人将通过剩余膳食接受足够量的Phe，在严格的方案下控制，使得整体膳食是低Phe膳食。特别是，建议患有这种疾病的孕妇遵守严格的Phe限制膳食方案，以避免胎儿发育受损和先天性畸形母源性PKU综合征的风险。近年来，已经表明，从Phe过量的状态表现出来的病理症状统称为高苯丙氨酸血症HPA，可以被分成多种离散性疾病，根据血浆Phe浓度和对PAH辅因子的反应性进行诊断。在初始水平，HPA可被分为由于生物喋呤代谢中的酶缺陷导致的辅因子6R-L-赤式-5,6,7,8-四氢生物蝶呤BH4缺乏引起的HPA恶性PKU，和由PAH缺乏引起的HPA。后者被进一步细分，产生至少四种亚类别，其取决于不存在膳食或其他治疗干预下的Phe血浆浓度本发明称为“无限制血浆Phe浓度”和对辅因子BH4的反应性。正常血浆Phe稳态受到严格控制，导致血浆Phe浓度为60μmolL±15μmolL。经典型PKUORPHA79254是最严重的PKU形式，它是由PAH中的无效或严重突变引起的，当未经治疗时，其导致不受限制的血浆Phe浓度大于1200μmolL。具有经典型或严重PKU的个体必须采用基于极低Phe膳食的严格膳食方案进行治疗，以将其Phe浓度降低至安全范围。更温和形式的PKU也已被表征。较不严重形式的PKU是表现为无限制血浆Phe浓度为10-20mgdL600-1200μmolL的PKU，通常称为“轻度PKU”ORPHA79253。这种中等程度形式的PKU通过使用适度的膳食限制来管理，例如：相对低蛋白质的膳食，不需要补充无Phe的氨基酸配方。轻度HPA，也称为良性或非PKU-HPAORPHA79651，其特征在于无限制血浆Phe浓度在180-600μmolL之间。患有非PKU-HPA的个体通常不被治疗，因为他们被认为具有在“安全”范围内的血浆Phe水平。在膳食PKU治疗中，目标范围是360μmolL，其在口服四氢生物蝶呤BH4；沙丙蝶呤sapropterin二盐酸盐后可以显著降低或标准化。这种轻度至中度形式的PKUHPA是由PAH基因中的特定突变引起的，其导致突变蛋白具有显著的残留酶活性。补充BH4作为PKUHPA管理的一部分使一些患者能够放松他们的Phe限制性膳食方案。应理解，本发明所用的术语“PKU治疗”或“PKU患者”意指用以下形式的HPA的治疗和患者，例如经典PKU、轻度PKU、轻度HPA和BH4反应性PKUHPA。在20世纪50年代早期的膳食PKU治疗开始时，通过蛋白质水解产物向患者提供必需氨基酸Phe除外。因此，具有相对高水平的必需氨基酸的蛋白质，例如酪蛋白哺乳动物乳中常见的蛋白质，占牛奶中蛋白质的80％或牛血清白蛋白被水解，然后通过肽的过滤步骤去除尽可能多的Phe污染，和或通过在包含水解蛋白质的混合物中结合游离氨基酸。今天，通常为患者提供包含必需氨基酸Phe除外的游离结晶氨基酸的平衡混合物。这样的氨基酸混合物会具有苦味，导致沙质口感并且对于一些用途来说会被认为是不合适的或不合需要的。结果，这种混合物有时包含调味剂以掩盖游离氨基酸和或水解蛋白质的味道。在一些情况下，发现其中一部分氨基酸含量由多肽或蛋白质提供的组合物比其中高比例的总氨基酸由游离氨基酸和或某些水解蛋白质提供的组合物具有更好的味道。然而，这种组合物的可用性受到限制，因为营养制剂传统上由分离自天然食品的蛋白质制成，例如从牛奶中分离的乳清，或从大豆中分离的大豆蛋白。这些蛋白质的氨基酸谱不一定满足哺乳动物的氨基酸要求。此外，商品蛋白质通常由蛋白质和或蛋白质水解产物的混合物组成，其蛋白质组成可以变化，因此导致其营养价值的不可预测性。此外，具有高生物学价值的此类蛋白质的有限数量的来源意味着只有某些氨基酸组合可被大规模获得以用于以蛋白质形式摄取。糖巨肽GMP是在制作奶酪期间产生的天然乳清蛋白，已用于治疗PKU。纯GMP缺乏芳香族氨基酸苯丙氨酸Phe；F、酪氨酸Tyr；Y和色氨酸Trp；W以及精氨酸Arg；R、组氨酸His；H和半胱氨酸Cys；C但富含大的中性氨基酸异亮氨酸Ile；I和苏氨酸Thr；T。作为市售的膳食蛋白质，它含有最少量的Phe。然而，用作PKU膳食管理的医疗食品中的单一蛋白质来源，其需要补充Trp、Arg、Leu、His和Tyr，以满足日常所需摄入这些必需和半必需氨基酸的需要并提供足够低的PheTyr比梅泰克斯营养学研究所有限责任公司用于治疗PKU的无苯丙氨酸的蛋白质M10927WORN16186895.52016年9月1日7PatentInversion3.51168PRT枯草芽孢杆菌1MetAlaLeuThrLysGluGlnThrGlnHisLeuTyrHisLysLeuLeu151015AspMetGlnLysGluLeuSerGlyGluLysLysGluThrGluSerMet202530ThrGluGluValGlyGluLeuSerAsnGlyValAspAsnHisMetAla354045AspHisGlyThrLeuValThrAspArgMetThrAspGlnThrValLys505560GluIleAspArgGluLeuLeuGluGluValAsnArgAlaLeuGlnLys65707580MetLysAspGlyThrTyrGlyValCysGluLysThrGlyGlnGluIle859095ProTyrGluArgLeuGluAlaValProTyrAlaArgMetThrValGlu100105110AlaGlnAlaAspValGluAspAspLeuGluThrAspAlaProSerTyr115120125GluArgGluPheHisGluGlnValLysAspLeuSerAsnLysGluThr130135140IleAspGlnLysSerSerGlnThrTyrGluIleLeuAspArgGluGln145150155160AspSerLysAlaAlaAlaSerArg1652168PRT人造序列GSP1052MetAlaLeuThrLysGluGlnThrGlnHisLeuTyrHisLysLeuLeu151015AspMetGlnLysGluLeuSerGlyGluLysLysGluThrGluSerMet202530ThrGluGluValGlyGluLeuSerAsnGlyValAspAsnHisMetAla354045AspHisGlyThrLeuValThrAspArgMetThrAspGlnThrValLys505560GluIleAspArgGluLeuLeuGluGluValAsnArgAlaLeuGlnLys65707580MetLysAspGlyThrTyrGlyValCysGluLysThrGlyGlnGluIle859095ProTyrGluArgLeuGluAlaValProTyrAlaArgMetThrValGlu100105110AlaGlnAlaAspValGluAspAspLeuGluThrAspAlaProSerTyr115120125GluArgGluTrpHisGluGlnValLysAspLeuSerAsnLysGluThr130135140IleAspGlnLysSerSerGlnThrTyrGluIleLeuAspArgGluGln145150155160AspSerLysAlaAlaAlaSerArg16536PRT人造序列Tag54的表位3LysAspTrpGluHisLeu15412PRT人造序列具有Phe--Ala替代的Tag544LysHisIleLysAspTrpGluHisLeuGluGluAla1510512PRT人造序列具有Phe--Tyr替代的Tag545LysHisIleLysAspTrpGluHisLeuGluGluTyr15106186PRT人造序列GSP105-6His-Tag54P156MetAlaLeuThrLysGluGlnThrGlnHisLeuTyrHisLysLeuLeu151015AspMetGlnLysGluLeuSerGlyGluLysLysGluThrGluSerMet202530ThrGluGluValGlyGluLeuSerAsnGlyValAspAsnHisMetAla354045AspHisGlyThrLeuValThrAspArgMetThrAspGlnThrValLys505560GluIleAspArgGluLeuLeuGluGluValAsnArgAlaLeuGlnLys65707580MetLysAspGlyThrTyrGlyValCysGluLysThrGlyGlnGluIle859095ProTyrGluArgLeuGluAlaValProTyrAlaArgMetThrValGlu100105110AlaGlnAlaAspValGluAspAspLeuGluThrAspAlaProSerTyr115120125GluArgGluTrpHisGluGlnValLysAspLeuSerAsnLysGluThr130135140IleAspGlnLysSerSerGlnThrTyrGluIleLeuAspArgGluGln145150155160AspSerLysAlaAlaAlaSerArgHisHisHisHisHisHisLysHis165170175IleLysAspTrpGluHisLeuGluGluAla1801857558DNA人造序列G105-6His-Tag54-P15枯草芽孢杆菌7atggcactgacaaaagaacaaacgcaacatctgtatcataaactgcttgacatgcaaaaa60gaactgagcggagaaaagaaagaaacggaatcaatgacagaagaagtcggtgaattaagc120aatggcgtagataaccatatggccgatcatggcacattggttacggatcgtatgacagac180caaacggtgaaagaaattgatagagaactgcttgaagaagtcaatcgcgcattacaaaaa240atgaaagatggcacatatggagtatgcgaaaaaacgggtcaggaaatcccgtatgaacgt300ttagaagcggtcccttacgctcggatgacagttgaagcccaagcagatgtggaagatgac360ttggaaacggacgcaccgtcttatgaacgcgaatggcatgaacaggtgaaagatctgtcc420aacaaagaaacaattgaccaaaaatcaagccagacgtacgaaatccttgatagagaacag480gactctaaagcggccgcttctagacatcatcatcatcatcataaacatatcaaagactgg540gaacatctggaagaagcc558

权利要求：1.重组膳食蛋白质，其包含与SEQIDNO2具有至少70％同一性的多肽序列或其营养充足部分，其中所述蛋白质不包含苯丙氨酸。2.权利要求1的重组膳食蛋白质，其中所述多肽序列与SEQIDNO2具有至少85％、优选90％、更优选95％同一性。3.权利要求1或2的重组膳食蛋白质，其中所述蛋白质进一步包含一种或多种其它蛋白序列，其中所述其它蛋白序列为纯化标签或标记。4.权利要求3的重组膳食蛋白质，其中所述其它蛋白序列为包含氨基酸序列SEQIDNO3的多肽标签。5.一种载体，其包含编码权利要求1至4任一项的重组膳食蛋白质的核酸序列。6.重组微生物，其包含权利要求5的载体。7.权利要求6的重组微生物，其中所述微生物选自埃希杆菌、克雷伯氏菌、假单胞菌、黄单胞杆菌、芽孢杆菌、葡萄球菌、酵母属、棒状杆菌、链霉菌、沙门氏菌、曲霉、葡糖杆菌、分枝杆菌、放线菌、柄杆菌、毕赤酵母属、谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母、肉毒梭状芽孢杆菌、肝素黄杆菌、乳酸乳球菌、扭脱甲基杆菌、游海假交替单细胞菌、真氧产碱杆菌、粗糙脉孢菌、Arxulaadeninivorans、多形汉森酵母、乳酸克鲁维斯酵母、拜耳接合酵母、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌和巨大芽胞杆菌。8.权利要求7的重组微生物，其中所述微生物为芽孢杆菌或假单胞菌的物种。9.权利要求8的重组微生物，其中所述微生物是枯草芽孢杆菌或荧光假单胞菌。10.制备权利要求1至4任一项的重组膳食蛋白质的方法，该方法包括将权利要求6至9任一项的重组微生物在适合通过所述重组微生物产生膳食蛋白质的条件下培养。11.膳食组合物，其包含权利要求1至4任一项的重组膳食蛋白质和任选其它赋形剂。12.权利要求1至4任一项的膳食蛋白质或权利要求11的膳食组合物，所述膳食蛋白质中每100g蛋白质包含不超过0.45g苯丙氨酸，所述膳食组合物中每100g总蛋白质包含不超过0.1g苯丙氨酸。13.权利要求1至4任一项的膳食蛋白质或权利要求11的膳食蛋白质组合物，其用作特殊医疗目的的药物和或食物。14.权利要求1至4任一项的膳食蛋白质或权利要求11的膳食蛋白质组合物，其用于治疗特征为体内苯丙氨酸积聚的疾病。15.权利要求1至4任一项的膳食蛋白质或权利要求11的膳食蛋白质组合物，其用于权利要求14中所述的用途，其中所述疾病是高苯丙氨酸血症，优选苯丙酮尿症。

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