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申请/专利权人：广州市达瑞生物技术股份有限公司

摘要：本发明为利用高通量液相色谱串联质谱法同时检测新生儿滤纸干血片中苯丙氨酸和17α‑羟孕酮的试剂盒，能够同时检测苯丙酮尿症和先天性肾上腺皮质增生症两种新生儿遗传代谢病。提供了较为简便的实验操作方法，包括内标工作液的配制，样本孵育，移液，上机检测四个步骤，简化了实验操作流程，提升检测效率。本发明试剂盒高通量、高准确性、高重复性，且操作简单，能够大大提高工作效率，降低对采血量的要求。

主权项：1.一种检测PKU和CAH的串联质谱试剂盒，其特征在于该试剂盒由校准品、质控品、内标准品、萃取液、流动相A液、流动相B液、96孔微孔板、操作说明书及其分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒组成；所述试剂盒各组成成分及其配制方法分别如下所述：1校准品：在抗凝的正常人全血中同时加入适量的苯丙氨酸和17‑羟孕酮原料，配制成包括6个浓度剂量点的校准品，滴制成滤纸干血片，即校准品A～F；2质控品：在抗凝的正常人全血中同时加入适量的苯丙氨酸和17‑羟孕酮原料，配制成包括高、低2个浓度的，滴制成滤纸干血片，即质控品C1和C2；3内标准品：使用50％～90％甲醇作为稀释液，将13C6苯丙氨酸和D8 17‑羟孕酮稀释至终浓度为300ngmL～400ngmL；4萃取液：由80％甲醇与草酸配制而成，草酸的含量为1nM～4nM；5流动相A：由甲酸与纯化水配制而成，甲酸的含量为0.05％～0.2％；6流动相B：由甲酸与纯甲醇配制而成，甲酸的含量为0.05％～0.2％；796孔微孔板：使用耐腐蚀的聚丙乙烯材料制成，包括无包被的96孔U型微孔板作为反应板和无包被的96孔V型微孔板作为进样板；8封片：用于实验过程尽量减少有机溶剂的挥发。

全文数据：一种检测PKU和CAH的串联质谱试剂盒技术领域本发明涉及苯丙氨酸和17-羟孕酮检测的技术领域，特别涉及一种高通量液相色谱串联质谱法同时检测新生儿滤纸干血片中苯丙氨酸和17-羟孕酮的成品试剂盒。背景技术苯丙酮尿症Phenylketonuria，PKU是一种由于人体正常染色体缺陷造成新生儿体内苯丙氨酸代谢紊乱性疾病。其发病机理是新生儿体内缺乏苯丙氨酸羟化酶phenylalaninehydroxylase，PAH，此酶可以将蛋白质中的苯丙氨酸水解为酪氨酸，便于人体吸收和利用。由于酪氨酸的形成途径被阻断，血液中的苯丙氨酸不能被水解，因此，苯丙氨酸在血、脑脊液、各种组织和尿液中的浓度极度增高，同时产生了大量苯丙酮酸、苯乙酸、苯乳酸和对羟基苯乙酸等旁路代谢产物并自尿中排出，这些代谢产物经汗及尿排出，使汗、尿带鼠尿或马粪气味。先天性肾上腺皮质增生症congenitaladrenalhyperplasia，CAH是一组常染色体隐性遗传、内分泌代谢失调病，分别由21-羟化酶、11b羟化酶、3b类固醇脱氢酶、17a羟化酶等缺陷所造成的，其中21-羟化酶缺乏症是CAH中最为多见的一种90％～95％，其共同特点是皮质醇合成障碍，引起促肾上腺皮质激素ACTH分泌增加导致肾上腺增生，出现脱水、失盐、外生殖器性别不清、生长加速、皮肤黏膜色素沉着、不同程度的男性化等各种不同临床表现。但可通过检测新生儿17-OHP浓度水平筛查出大部分CAH患儿，并经过及时及早的治疗，病情可以得到有效的控制。17-羟孕酮17-hydoxyprogesterone，17-OHP是一种内源性孕激素，由肾上腺皮质及性腺产生，是最常用的筛查CAH的敏感指标。苯丙酮尿症、CAH和呆小症已经成为新生儿必筛项目。苯丙氨酸和17-羟孕酮均属于小分子代谢物，目前检测新生儿采血滤纸片上的苯丙氨酸市售试剂盒主要以荧光分析法为主，该法利用苯丙氨酸与茚三酮和二肽反应生成荧光物质进行定量检测，主要存在灵敏度低、特异性差、荧光物质半衰期短、容易被污染、假阳性高等问题；检测新生儿采血滤纸片上的17-羟孕酮市售试剂盒主要以时间分辨免疫荧光法为主，该法利用抗原抗体“竞争法”检测17-羟孕酮的含量，存在免疫“竞争法”不可避免的问题：特异性低，不同抗原或者抗体的对检测结果影响很大，不同厂家的试剂测值差异大，准确性低等。而且，目前所有市售试剂盒一次实验只能检测单一指标，不能实现一次实验同时检测苯丙氨酸和17-羟孕酮两个标志物，不仅工作效率低，也加大了采血量的要求。因此，本技术领域迫切需要解决这样一个问题：如何能够提供一种简单方便的、高通量的、准确性高的、重复性好的，用于同时检测新生儿采血滤纸片上的苯丙氨酸和17-羟孕酮的试剂盒。发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种适用于同时检测新生儿采血滤纸片上的苯丙氨酸和17-羟孕酮的高通量、高准确性、高重复性试剂盒，操作简单，能够大大提高工作效率，降低对采血量的要求。为了解决上述问题，本发明公开了一种高通量液相色谱串联质谱法同时检测新生儿采血滤纸片上的苯丙氨酸和17-羟孕酮的成品试剂盒，包括：一、试剂盒组成成分及配制1、校准品：在抗凝的正常人全血中同时加入适量的苯丙氨酸和17-羟孕酮原料，配制成包括6个浓度剂量点的校准品，滴制成滤纸干血片。优选的6个浓度剂量点校准品按照苯丙氨酸：0.5mgdL、1.0mgdL、2.0mgdL、4.0mgdL、8.0mgdL、16.0mgdL，17-羟孕酮：0nmolL、15nmolL、30nmolL、60nmolL、120nmolL、240nmolL设置，并且可溯源至4thISNS-RPNS。2、质控品：在抗凝的正常人全血中同时加入适量的苯丙氨酸和17-羟孕酮原料，配制成包括高、低2个浓度的质控品，滴制成滤纸干血片。优选的2个浓度的质控品按照苯丙氨酸：1.5mgdL、6.0mgdL，17-羟孕酮：20nmolL、90nmolL设置。3、内标准品：使用50％～90％甲醇作为稀释液，优选80％甲醇，同时将13C6苯丙氨酸和D817-羟孕酮稀释至终浓度为300ngmL～400ngmL，优选350ngmL。4、萃取液：由80％甲醇与草酸配制而成，草酸的含量为1nM～4nM，优选3nM。5、流动相A：由甲酸与纯化水配制而成，甲酸的含量为0.05％～0.2％，优选0.1％。6、流动相B：由甲酸与纯甲醇配制而成，甲酸的含量为0.05％～0.2％，优选0.1％。7、96孔微孔板：使用耐腐蚀的聚丙乙烯材料制成，包括U型底无包被的96孔微孔板作为反应板和V型底无包被的96孔微孔板作为进样板。8、封片：用于实验过程尽量减少有机溶剂的挥发。9、操作说明书。10、分隔并集中包装上述1～9的包装盒。二、试剂盒应用方法本发明试剂盒的使用方法包括如下步骤：1、内标工作液的配制：使用萃取液按照适合的比例稀释内标准品，配制成内标工作液，优选的稀释比例为内标准品∶萃取液＝1∶99。2、孵育：轧下小血片每片直径3mm左右移入96孔微孔板U型底，无包被孔中，然后各孔适量的内标工作液，优选100μL孔。盖上封片，在合适的条件下孵育，优选37℃振动孵育45分钟。3、移液：从每个板孔中将适量萃取后的溶液转移到96孔微孔板V型底，无包被孔内，优选75μL孔。4、色谱条件准备设置：优选的，Poroshell120EC-C184.6*50mm色谱柱，0.6mLmin0.0～1.5min：A流动相：45％；1.5～2.5min：A流动相：45％→10％；2.5～4.0min：A流动相：10％；4.0～4.01min：A流动相：10％→45％；4.01～5.0min：A流动相：45％，35℃柱温。5、质谱条件准备设置：优选的，ESI正离子MRM扫描模式，Q1Q3离子通道分别选择为苯丙氨酸：166.1→120.1amu，苯丙氨酸内标：172.2→126.1amu；17-羟孕酮：331.2→109.2amu；17-羟孕酮内标：339.1→117.2amu。6、上机检测：将适量萃取后液体进入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测分析，优选20μL，并记录色谱图与检测样品中苯丙氨酸和17-羟孕酮的峰面积与内标峰面积。7、结果分析：以6个校准品的标示浓度为横坐标x，实际检测峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标y，绘制标准曲线和计算曲线回归方程，将样本中的实际检测峰面积与内标峰面积的比值代入标准曲线回归方程，即可计算出样品中苯丙氨酸和17-羟孕酮的浓度。本发明具有以下特点：1.本试剂盒是利用液相色谱串联质谱技术，可在干血片上同时检测新生儿苯丙酮尿症和先天性肾上腺皮质增生症，不仅可以降低采血需求，还可以快速有效地提高新生儿遗传代谢病的筛查通量。2.本试剂盒所检测的样本为干血片，干血片不仅具有实验操作简便，还具备运输、保存方便的特点，可以大大减少疾病检测的管理成本，从而提升临床检测工作效率；3.本试剂盒使用的检测方法为液相质谱串联质谱法，根据分析物固有的理化性质质荷比mz进行直接检测样本中的苯丙氨酸和17-羟孕酮，不仅能够消除荧光法或免疫分析法等传统间接检测方法造成的灵敏度低、特异性差、准确性低，而且该方法能使其检测结果具有不同平台间的可比性。附图说明图1.实验操作步骤。具体实施方式本发明为一种滤纸干血片中同时检测苯丙酮尿症PKU和先天性肾上腺皮质增生症CAH的串联质谱试剂盒，提供了一种简单方便的、高通量的、准确性高的、重复性好的，用于同时检测新生儿采血滤纸片上的苯丙氨酸和17-羟孕酮的临床检测盒。为了使本发明实施的上述目的、特征和有点能够更加清晰易懂，具体包括试剂盒组成成分和操作方法。实施例1：试剂盒组成及其成分实施例2：试剂盒的操作方法示意图如图11、内标工作液的配制：按内标准品∶萃取液＝1∶99把内标准品稀释100倍，配制成内标工作液1.0mL内标准品+99mL萃取液；2、孵育：用打孔器在滤纸干血片校准品、质控品和待测样品上轧下小血片每片直径3mm左右，按顺序把扎下的血片移入96孔微孔板U型底，无包被孔中，然后各孔加入100μL内标工作液，盖上封片，37℃振动孵育45分钟。3、移液：从每个板孔中将75μL萃取后的溶液转移到96孔微孔板V型底，无包被孔内。4、上机检测：选取萃取后液体各20μL进入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测分析，并记录色谱图与检测样品中苯丙氨酸和17-羟孕酮的峰面积与内标峰面积。1色谱条件：a色谱柱：Poroshell120EC-C184.6*50mm或相当者；b流动相：A流动相，B流动相；c流速：0.6mLmin；d梯度洗脱条件：e柱温：35℃；f进样量：20μL。2质谱条件：a离子源b扫描模式5、检测结果的计算：1标准曲线的绘制方法：以6个校准品的标示浓度苯丙氨酸：0.5mgdL、1.0mgdL、2.0mgdL、4.0mgdL、8.0mgdL、16.0mgdL；17-羟孕酮：0nmolL、15nmolL、30nmolL、60nmolL、120nmolL、240nmolL为横坐标x，以6个校准品的实际检测峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标y，绘制标准曲线。2标准曲线方程的拟合：以6个校准品的峰面积比值y对标示浓度x进行线性回归。可获得回归方程：y＝a+bx，其中y为纵坐标，x为横坐标，a为截距，b为斜率，并计算相关系数r，要求r不小于0.9900。3血清样品结果的计算：将血清样品中叶酸的实际检测峰面积与内标峰面积的比值代入标准曲线方程，计算样品中苯丙氨酸和17-羟孕酮的浓度。对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权力要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权力要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的人和附图标记视为限制所涉及的权利要求。

权利要求：1.一种检测PKU和CAH的串联质谱试剂盒，其特征在于该试剂盒由校准品、质控品、内标准品、萃取液、流动相A液、流动相B液、96孔微孔板、操作说明书及其分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒组成；所述试剂盒各组成成分及其配制方法分别如下所述：1校准品：在抗凝的正常人全血中同时加入适量的苯丙氨酸和17-羟孕酮原料，配制成包括6个浓度剂量点的校准品，滴制成滤纸干血片，即校准品A～F；2质控品：在抗凝的正常人全血中同时加入适量的苯丙氨酸和17-羟孕酮原料，配制成包括高、低2个浓度的，滴制成滤纸干血片，即质控品C1和C2；3内标准品：使用50％～90％甲醇作为稀释液，将13C6苯丙氨酸和D817-羟孕酮稀释至终浓度为300ngmL～400ngmL；4萃取液：由80％甲醇与草酸配制而成，草酸的含量为1nM～4nM；5流动相A：由甲酸与纯化水配制而成，甲酸的含量为0.05％～0.2％；6流动相B：由甲酸与纯甲醇配制而成，甲酸的含量为0.05％～0.2％；796孔微孔板：使用耐腐蚀的聚丙乙烯材料制成，包括无包被的96孔U型微孔板作为反应板和无包被的96孔V型微孔板作为进样板；8封片：用于实验过程尽量减少有机溶剂的挥发。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于所述校准品A～F分别对应的苯丙氨酸和17-羟孕酮浓度依次为：1苯丙氨酸：0.5mgdL、1.0mgdL、2.0mgdL、4.0mgdL、8.0mgdL、16.0mgdL；217-羟孕酮：0nmolL、15nmolL、30nmolL、60nmolL、120nmolL、240nmolL。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于所述的质控品C1和C2分别对应的苯丙氨酸和17-羟孕酮浓度依次为：1苯丙氨酸：1.5mgdL、6.0mgdL；217-羟孕酮：20nmolL、90nmolL。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于，所述试剂盒通过检测滤纸干血片中的代谢物苯丙氨酸和17α-羟孕酮，能够同时检测苯丙酮尿症和先天性肾上腺皮质增生症两种新生儿遗传代谢病。

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