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申请/专利权人：河南农业大学
摘要：本发明公开了一种用于无痕敲除肺炎克雷伯菌基因的双交换基因编辑方法，属于基因工程技术领域。本发明的双交换基因编辑方法，提高了肺炎克雷伯菌的特定基因如耐药及其调控基因和功能表达基因等无痕编辑效率，熟化载体质粒和自杀质粒的稳定性和相容性，提高同源重组效率、转化效率、反向筛选机率及抗性标记的消除速率，确保阳性克隆的有效表达，在节省基因编辑时间的同时确保了基因组的的稳定性。
主权项：1.一种用于无痕敲除肺炎克雷伯菌基因的双交换基因编辑方法，其特征在于，包括如下步骤：1克隆抗性标记片段；克隆靶基因上下游800-1000bp长度的上游同源打靶片段和下游同源打靶片段；2以步骤1中得到的所述抗性标记片段、所述上游同源打靶片段和所述下游同源打靶片段为模板，进行SOE-PCR反应，得到SOE-PCR产物；3将所述SOE-PCR产物与含有sacB基因的自杀质粒连接，得到重组自杀质粒，并转化入大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌；4将所述重组大肠杆菌与肺炎克雷伯菌进行双本接合，采用含所述抗性标记的平板进行筛选，得到重组肺炎克雷伯菌；5将所述重组肺炎克雷伯菌进行蔗糖琼脂反向筛选和菌落PCR验证，得到靶基因敲除的肺炎克雷伯菌；6将FLP重组酶质粒pAT03-Apr转入所述靶基因敲除的肺炎克雷伯菌中，诱导FLP重组酶表达，然后交叉使用含阿泊拉霉素的平板和含所述抗性标记的平板进行筛选后，培养2-3代，得到靶基因无痕敲除的肺炎克雷伯菌。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 河南农业大学 一种用于无痕敲除肺炎克雷伯菌基因的双交换基因编辑方法
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