买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：青岛大学

摘要：本发明属于蛋白质纯化技术领域，涉及原核表达高效获取Cullin1‑Rbx1E3连接酶复合物的方法，将优化改造的Cullin1‑Rbx1融合蛋白与Skp1‑Skp2、Cks1在反应体系中进行反应，得到E3连接酶复合物；在Cullin1的N端引入MsyB标签能够提高蛋白质的溶解性，解决原核表达系统中Cullin1难以折叠的问题；将Cullin1和Rbx1共表达，减少各自单独存在时的错误折叠和聚集；这些改进使得能够在更短的时间内便捷高效地表达和纯化Cullin1‑RBX1融合蛋白，为后续的生化结构机制研究奠定了基础；本发明制备E3连接酶复合物的方法简单、高效，适于大规模推广使用。

主权项：1.原核表达高效获取Cullin1-Rbx1E3连接酶复合物的方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）通过原核表达手段获取Cullin1-Rbx1融合蛋白：1）构建重组载体MsyB-Cullin1-Rbx1-His：对人类Cullin1基因进行了密码子优化，在其N端添加了MsyB增溶标签和HRV3C酶切位点，然后，将优化后的Cullin1克隆到pET29a载体的第一个核糖体结合位点后面；接着，对人类Rbx1基因进行了密码子优化，在其N端添加6XHis标签和HRV3C酶切位点，并将其克隆到pET29a载体的第二个核糖体结合位点后面，得到重组载体MsyB-Cullin1-Rbx1-His；2）融合蛋白Cullin1-Rbx1的表达：通过热激法把重组载体MsyB-Cullin1-Rbx1-His转化入大肠杆菌BL21（DE3）中，在含卡那霉素的LB平板上培养过夜；然后取含有重组质粒的阳性单菌落，接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，振荡培养10~12h，将培养的菌液接种到新鲜的含卡那霉素的LB液体培养基中，振荡培养至菌液浓度OD600在0.8~1.2，然后加入诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，继续培养10-26h后，离心，收集并重悬菌体；将离心收集的菌体，用50mMHEPES150mMNaCl缓冲液重悬，加入苯甲基磺酰氟，混匀，于冰上超声破碎；然后离心，获取含有蛋白的上清液；3）融合蛋白Cullin1-Rbx1的纯化：采用镍柱纯化，将获取的上清液与镍柱孵育后用咪唑洗杂和洗脱，收集洗脱液并用PreScission蛋白酶裂解蛋白质以去除His标签，将洗脱液在透析缓冲液中透析过夜；第二天再用滤膜过滤上样至SourceS10300GL色谱柱中，线性梯度洗脱分离；得到纯净的Cullin1-Rbx1融合蛋白；（2）Cullin1-Rbx1E3连接酶的制备：将蛋白成分接头蛋白Skp1-Skp2、Cks1和Cullin1-RBX1在反应体系中进行反应，反应条件为：冰上孵育一小时，得到Cullin1-Rbx1E3连接酶复合物。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 青岛大学 原核表达高效获取Cullin1-Rbx1 E3连接酶复合物的方法