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申请/专利权人：四川农业大学

摘要：本发明公开了一种用于鉴别诊断PCV2和PEDV病毒的引物，包括引物PEDV‑F、引物PEDV‑R、PCV2‑F和引物PCV2‑R；其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。本发明通过对复合PCR反应体系和反应条件的优化，得到的用于鉴别诊断PCV2和PEDV病毒的方法。能够捕获更多信息且快速精确检测出微量核酸，提升了鉴别、检测的敏感性及特异性，能够快速、特异的检测猪流行性腹泻病毒及猪圆环病毒2型，大大提高了这两种病毒的检测效率。

主权项：1.一种用于鉴别PCV2和PEDV病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：用用于鉴别PCV2和PEDV病毒的复合PCR引物对待测样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；用琼脂糖凝胶电泳或测序法检测扩增产物；扩增产物大小为530bp，则样本中含有或候选含有猪流行性腹泻病毒；扩增产物大小为278bp，则样本中含有或候选含有猪圆环病毒2型；本方法用于非诊断和治疗目的；用于鉴别PCV2和PEDV病毒的复合PCR引物包括PEDV引物对和PCV2引物对；PEDV引物对包括引物PEDV-F和引物PEDV-R，所述PCV2引物对包括引物PCV2-F和引物PCV2-R；所述引物PEDV-F、引物PEDV-R、引物PCV2-F和引物PCV2-R的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；所述复合PCR扩增的退火温度为63℃；复合PCR扩增的反应体系为25μL，其中，10×bufferMg2+free2.5μL、dNTPMix2.0μL、MgCl21.5μL、TakaraTaqHs0.2μL、引物PEDV-F、引物PEDV-R、引物PCV2-F和引物PCV2-R各1.0μL、DNA或cDNA模板1.0μL，其余用ddH2O补足；复合PCR扩增的反应程序为95℃预变性5min；95℃30s、63℃30s、72℃30s，共35个循环；72℃延伸7min。

全文数据：一种用于鉴别诊断PCV2和PEDV病毒的方法及引物技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种用于鉴别诊断PCV2和PEDV病毒的方法及引物。背景技术[0002]猪流行性腹泻病毒porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV冠状病毒，PEDV基因组单股正链的RNA，全长27~33kb。主要经消化道感染能够引起猪病毒性腹泻，多发生于冬、春两季。病猪和带毒猪是主要传染源，病毒随粪便排出后污染周围环境和饲养用具，散播传染。这种急性肠道传染病在临床上的主要特征为体温急剧升高，极度口渴，饮水量增加，不愿采食或停止采食，呕吐，随后剧烈腹泻并迅速脱水。PEDV可以感染各年龄猪，哺乳猪、架子猪或肥育猪的发病率很高，其中对仔猪的危害最大，严重影响饲料转化率，导致大量仔猪死亡。近年来，全国各猪场爆发了严重的猪流行性腹泻疫情。[0003]猪圆环病毒2型PCV2是圆环病毒科、圆环病毒属的重要成员，基因组为单分环状的单股DNA，大小小于2.5kb。可以引起断奶仔猪多系统衰竭综合征PMWS、猪皮炎肾病综合征PDNS、猪呼吸道复合体病和繁殖障碍PRDC等多种疾病。该病毒是目前发现的一种最小的动物病毒，对猪具有免疫抑制特性。目前，猪PCV2的感染率较高，具有很强的免疫抑制作用，降低了猪对其它病原的抵抗能力，从而引发多种病原的混合感染。[0004]综上，两种病毒均对我国养猪业造成了严重的经济损失。均可引起断奶仔猪渐进性消瘦、呼吸困难、腹泻甚至死亡等，且在临床上混合感染率较高。[0005]由于分子生物学的不断发展，PCR检测技术因具有操作简便、耗时短、特异性高且结果精确等特点，在日常检测中得到广泛应用。但随着猪场集约化养殖的不断发展，密集型饲养方式以及猪群的跨区域流通导致猪群之间接触的几率增大，导致患病猪群多呈现混合感染现象。因此，建立快速有效检测两种疾病的方法显得十分关键。在以往的疾病检测中，使用传统的单项PCR、PR_PCR检测方法难免费时费力。发明内容[0006]有鉴于此，本发明针对单项PCR、RT-PCR只能分别诊断PCV2、PEDV的问题，提供了一种用于鉴别诊断PCV2和PEDV病毒的方法及引物，以解决现有技术中缺乏一种能够同时诊断PCV2、PEDV病毒的方法的技术问题。[0007]为了解决上述技术问题，本发明公开了一种用于鉴别诊断PCV2和PEDV病毒的引物，包括PEDV引物对和PCV2引物对;PEDV引物对包括引物PEDV-F和引物PEDV-R，所述PCV2引物对包括引物PCV2-F和引物PCV2-R;[0008]所述引物PEDV-F、引物PEDV-R、引物PCV2-F和引物PCV2-R的核苷酸序列分别如SEQIDN0·1、SEQIDN0·2、SEQIDN0·3和SEQIDN0·4所示。[0009]本发明还公开了一种用于鉴别诊断PCV2和PEDV病毒的方法，包括以下步骤：[0010]用上述的引物、对待测样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物;用琼脂糖凝胶电泳或测序法检测扩增产物；[0011]扩增产物大小为530bp，则样本中含有或候选含有猪流行性腹泻病毒；[0012]扩增产物大小为278bp，则样本中含有或候选含有猪圆环病毒2型；[0013]本方法用于非诊断和治疗目的。[0014]进一步地，复合PCR扩增的退火温度为63°C。[0015]进一步地，复合PCR扩增的反应体系为25yL，其中，lOXbufferMg2+free2.5yL、dNTPMix2.0yL、MgCl21.5yL、TakaraTaqHs0.2yL、引物PEDV-F、引物PEDV-R、引物PCV2-F和引物PCV2-R各1·0yL、DNA或cDNA模板1·OyL，其余用ddH20补足。[0016]进一步地，复合PCR扩增的反应程序为95°C预变性5min;95°C30s、63°C30s、72°C30s，共35个循环；72°C延伸7min。[0017]与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：[0018]1本发明复合PCR方法是在同一反应体系中加入两对引物对两个目的基因同时进行PCR扩增的实验方法。所以具有省时、省力、降低检测成本、减少样品污染等优点现已发展成一种通用检测技术，并成功用于分子遗传学、疾病诊断、病原鉴别等各个方面。[0019]2本发明的复合PCR能够捕获更多信息且快速精确检测出微量核酸，提升了鉴别、检测的敏感性及特异性，能够鉴别诊断PCV2和PEDV病毒。[0020]3本发明提供了一种PEDV、PCV2复合PCR检测技术，能够快速、特异的检测猪流行性腹泻病毒PHV及猪圆环病毒2型，大大提高了这两种病毒的检测效率。[0021]4本发明设计的特异性引物，以两种病毒的DNA、cDNA作为模板进行复合PCR方法的构建与优化，发现在退火温度为63°C时其扩增效果最好，无任何非特异扩增条带。本发明建立一种同时检测猪流行性腹泻病毒PEDV、猪圆环病毒2型PCV2两种疾病的复合PCR检测方法。在对临床样品的检测比较中笔者发现，复合PCR与单项PCR、RT-PCR检测的符合率达到100%且成本更低，方便快捷，具有特异性高、灵敏度强、结果准确的优点。[0022]当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明[0023]此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：[0024]图1是本发明单一PCR检测结果；其中，M:DNA分子质量标准；1:PCV2+PEDV;2:PEDV3:PCV2;4:阴性对照；[0025]图2是本发明不同浓度的dNTPMix的复合PCR扩增结果；其中，M:DNA分子质量标准；l:dNTPMix1.0yL;2:dNTPMix1.5yL;3:dNTPMix2.0yL;4:dNTPMix2.5yL;5:阴性对照；[0026]图3是本发明不同浓度的Mg2+的复合PCR扩增结果；其中，M:DNA分子质量标准；1:Mg2+2·5yL;2:Mg2+2·OyL;3:Mg2+1·5yL;4:Mg2+1·OyL;5:阴性对照；[0027]图4是本发明不同浓度的TaqHs酶的复合PCR扩增结果；其中，M:DNA分子质量标准；l:TaqHs0.5yL;2:TaqHs0.4yL;3:TaqHs0.3yL;4:TaqHs0.2yL;5:阴性对照；[0028]图5是本发明不同退火温度的复合PCR扩增结果；其中，M:DNA分子质量标准；1:56.6〇C；2：57.5〇C；3：58.6〇C；4：60.0〇C；5：61.7〇C；6：63.0〇C；7：64.2〇C；8：65.2〇C；9：65.7°C;10:66.0°C;11:阴性对照；[0029]图6是本发明不同引物浓度的复合PCR扩增结果；其中，M:DNA分子质量标准；1:PCV20.5yL^PEDV0.5yL；2：PCV20.8yLPEDV0.8yL；3：PCV2l.OyL^PEDV1.0yL；4：PCV21.5yL、PEDV1.5yL;5:PCV21.8yL、PEDV1.8yL;6:PCV22.0yL、PEDV2.0yL;7:阴性对照；[0030]图7是本发明复合PCR的特异性试验;其中，M:DNA分子质量标准；1:PRV;2:PRRSV;3:PPV;4:PCV2;5:PEDV;6:PCV2+PEDV;7:阴性对照；[0031]图8是本发明复合PCR的重复性试验;其中，M:DNA分子质量标准；1:阴性对照;2、3、4、5:分别为同一模板的5次扩增结果；[0032]图9是本发明复合PCR的敏感性试验，其中，M:DNA分子质量标准；1-7:模板的稀释度分别为10°、1〇-1、1〇-2、1〇-3、1〇-4、1〇-5、1〇-6;8:阴性对照。具体实施方式[0033]以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。[0034]实施例1同时鉴别诊断PCV2、PEDV病毒的方法的构建[0035]1PCV2、PEDV的引物设计及合成[0036]根据GenBank已发表的猪流行性腹泻病毒PEDV，猪圆环病毒2型PCV2基因的核苷酸序列，分别设计一对特异引物PEDV-F、PEDV-R和PCV2-F、PCV2-R见表1，预计扩增产物大小分别为530bp和278bp，由生工生物功率上海股份有限公司合成。[0037]表1复合PCR所用引物序列[0038][0039]2组织的处理及DNA、RNA的提取[0040]2.1组织的处理：[0041]将研钵用酒精棉球擦拭干净并火焰灭菌然后充分预冷备用;选取适量病变组织，尽量剪碎;将组织放在研钵里，加入适量液氮，将组织小心磨碎至粉末状，加入适量生理盐水最终倒进EP管内备用。[0042]2.2DNA的提取：[0043]准备好待用试剂：异丙醇、氯仿氯仿：异戊醇，24:1、75%冰乙醇；将上述处理好的病料反复冻融3次后，再离心8000r2-3min;病料离心后，取上清液600yL;加600yL饱和酚，摇匀静止5min，离心12000r5min;取上清液，分别加入氯仿配比液、饱和酚各200yL，摇勾，静止5min，离心12000r5min;重复上一步；取上清液，加400yL氯仿配比液，摇勾，静止5min，离心12000r5min;取上清200yL，加2倍体积异丙醇，轻轻摇匀，放入-20°C冰箱，冻20_60min;取出离心，1200015min，弃上清，加入1000yL冰乙醇，混勾，静止5min，离心12000r5min;弃上清慢倒出），倒置，晾干至无酒精味，最后加入灭菌TE缓冲液30-40yL，放入-20°C保存备用。[0044]2.3RNA的提取以及RNA的反转录：[0045]将上述处理好的病料反复冻融3次后，再离心8000r2-3min;病料离心后，取上清液300yL，加入DEPC水处理后的EP管，加入700yLTrizol，震荡混合，室温静止5min;加入200μL氯仿配比液，混合后静止5min，离心12000r15min，取上清液加入DEPC水处理后的ΕΡ管；加入等体积异丙醇，轻轻摇匀，冰上静止l〇min，离心12000r10min;加入ΙΟΟΟμΙ^Κ乙醇DEPC配制），混勾，离心12000r5min;弃上清慢倒出），倒置，瞭干至无酒精味。最后加入灭菌ΤΕ缓冲液30_40yL。[0046]用上一步骤中所得mRNA为模板，加入反转录试剂，按表2所示。将PCR管放入PCR仪，经37°C反转录15min;85°C灭活5s，放入-20°C保存备用。[0047]表2反转录体系[0048][0049][0050]3复合PCR扩增及反应条件[0051]用上一步骤所得DNA、cDNA为模板，扩增基因。复合PCR反应总体系25yL:10XbufferMg2+Free2·5yL、dNTPMix2yL、MgCl21·5yL、TakaraTaqHsO·2yL、上游和下游引物各lyL、DNA与cDNA模板各lyL，其余用ddH20补足。反应程序为:95°C预变性5min;95°C30s、63°C3〇8、721：3〇8，共35个循环;72°：延伸71^11。并通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果。[0052]4复合PCR产物的鉴定[0053]将复合PCR鉴定阳性的重组质粒送生工生物工程上海股份有限公司测序，测序结果显示，各特异性引物扩增的基因序列与NCBI上登录的各病毒的基因序列同源性均达98%以上，表明扩增片段分别为各自病毒的特异性条带。[0054]5、实验结果[0055]5.1单一卩〇財广增[0056]以前期制备的DNA和cDNA为模板，用各自特异性引物进行扩增，并对PCV2和PEDV进行复合PCR扩增，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳。单项PCR与复合PCR均能扩增出清晰条带，大小分别与预期的530bp和278bp相符合，而其他病毒的核酸和ddH20阴性对照并没有扩增出条带。并将产物送至擎科生物公司测序，NCBIBlast比对结果显示，核苷酸序列同源性均为99%，表明扩增片段分别为各自病毒的特异性条带图1。[0057]5.2dNTPMix、Mg2+、TaqHs酶用量优化[0058]通过单一变量，分别只改变dNTPMix、Mg2+、TaqHs的用量，结果显示，25yL反应体系中当dNTPMix、Mg2+、TaqHs酶用量分别为2.0、1.5、0.2yL时扩增的两条条带最清晰（图2、图3、图4。[0059]5.3引物浓度和退火温度的优化[0060]结果显示，引物的最佳使用量分别为PCV2、PEDV各1.0yL;63°C为最佳退火温度（图5、图6。[0061]5.4复合PCR扩增及体系的优化[0062]扩增条件如下：反应体系（2541^10\1311打6『]\%2+打662.541^、1町？]\^叉2.^1^、MgCh1.5yL、TakaraTaqHs0.2yL、上游和下游引物各1.0yL、DNA或cDNA模板l.OyL，其余用ddH20补足。反应程序为：95°C预变性5!1^11;951€3〇8、631€3〇8、721€3〇8，共35个循环；721€延伸7min，其反应结果最佳。[0063]5.5特异性检测[0064]利用已建立的复合PCR，以前期所提取的DNA和cDNA为模板，进行复合PCR扩增，电泳检测结果显示，复合PCR能特异性扩增PEDV和PCV2,产物大小分别约为530bp和278bp。将带有PRV、PPV病毒的DNA，及PRRSV病毒RNA反转录成的cDNA随机混合，在已优化的反应条件下进行复合PCR扩增，同时以ddH20做阴性对照进行检测，其扩增产物能够被明显的区分开来，并且不会出现非特异性扩增，证实了PCR扩增的特异性图7。[0065]5.6重复性实验[0066]应用复合PCR方法对同一阳性模板进行检测，4次实验的结果均一致，表明本实验方法的重复性良好图8。[0067]5.7敏感性实验[0068]结果显示，采用复合PCR扩增条件来扩增倍比稀释的PCV2、PEDV的质粒浓度混合模板，扩增结果如图9所示，推算出PCV2、PEDV的最低检出量分别为4.38X104copiesAiL、3.30X104copiesyL〇[0069]实施例2临床样本检测：[0070]从四川乐山、宜宾、广元和遂宁等地采集的67份腹泻病料提取病料中总RNA、DNA，按照本试验建立的复合PCR扩增体系和扩增条件进行检测，并设立阴阳性对照，取PCR产物6yL在1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳后判定结果:PEDV单一感染阳性率为34.33%，PCV2单一感染阳性率为73.13%;"PEDV+PCV2"复合感染率为16.42%。经与特异性检测？^2的卩0?和检测PEDV的RT-PCR检测结果进行比较分析符合率均为100%如表3和表4。[0071]表1PEDV和PCV2的检测结果[0072][0075]上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

权利要求：1.一种用于鉴别诊断PCV2和PEDV病毒的复合PCR引物，其特征在于，包括PEDV引物对和PCV2引物对;PEDV引物对包括引物PEDV-F和引物PEDV-R，所述PCV2引物对包括引物PCV2-F和引物PCV2-R;所述引物PEDV-F、引物PEDV-R、引物PCV2-F和引物PCV2-R的核苷酸序列分别如SEQIDN0·1、SEQIDN0·2、SEQIDN0·3和SEQIDN0·4所示。2.-种用于鉴别诊断PCV2和PEDV病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：用权利要求1中所述的引物、对待测样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；用琼脂糖凝胶电泳或测序法检测扩增产物；扩增产物大小为530bp，则样本中含有或候选含有猪流行性腹泻病毒；扩增产物大小为278bp，则样本中含有或候选含有猪圆环病毒2型；本方法用于非诊断和治疗目的。3.根据权利要求2所述的用于鉴别诊断PCV2和PEDV病毒的方法，其特征在于，所述复合PCR扩增的退火温度为63°C。4.根据权利要求2所述的用于鉴别诊断PCV2和PEDV病毒的方法，其特征在于，复合PCR扩增的反应体系为2541^，其中，10\131^€61]\%2+打662.541^、1町？]\^12.^1^、]\%：121.54L、TakaraTaqHs0.2yL、引物PEDV-F、引物PEDV-R、引物PCV2-F和引物PCV2-R各1.0yL、DNA或cDNA模板1.OyL，其余用ddH20补足。5.根据权利要求2所述的用于鉴别诊断PCV2和PEDV病毒的方法，其特征在于，复合PCR扩增的反应程序为95°C预变性5111丨11;951€3〇8、631€3〇8、721€3〇8，共35个循环；72°：延伸7min〇

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