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申请/专利权人：南京森林警察学院

摘要：本发明涉及一种濒危动物马来穿山甲个体识别STR分子标记开发及应用，属于动物的测定和检验技术领域。马来穿山甲STR分子标记的开发包括马来穿山甲DNA样本的提取、初筛引物的确定、初筛引物的合成、第一次STR‑PCR筛选扩增、第二次STR‑PCR筛选扩增、毛细管电泳浓度的确定、毛细管电泳检测和STR分子标记的分析等过程，共开发了16个用于马来穿山甲个体识别的STR分子标记位点。进行马来穿山甲个体识别时经过马来穿山甲STR分子标记分型图谱的获得、不同马来穿山甲样本同一性认定的统计学计算和同一性认定等过程。该方法可以有效解决对偷猎马来穿山甲案件的准确量刑问题。

主权项：1.一种马来穿山甲STR分子标记引物在马来穿山甲个体识别上的应用，其特征在于，具体包括如下内容：S1：马来穿山甲STR分子标记分型图谱的获得：剪取待检测马来穿山甲的肌肉组织或鳞甲组织，按磁珠法提取待检测马来穿山甲的样本DNA；随后以其为模板DNA，进行荧光STR-PCR复合扩增，分别扩增16个STR分子标记；得到的荧光STR-PCR复合扩增产物通过毛细管电泳偶联荧光检测技术进行检测，电泳、荧光检测结果用GeneMapper软件进行分析，获得样本STR分子标记的分型图谱，所述马来穿山甲STR分子标记引物核苷酸序列如表6所示：表6扩增马来穿山甲STR分子标记所用引物序列 S2：不同马来穿山甲样本同一性认定的统计学计算：当两份样本在所检测的16个基因座的STR分型，有1个以上位点不一致时，即排除两份样本来自同一个体；当两份样本在所检测的16个基因座的STR分型完全一致时，需计算其个体识别的证据强度，即似然率；S3：同一性的认定：1当两份样本在所检测的16个基因座的STR分型完全一致，且似然率大于或等于1×104时，不排除两份样本的同一性；当似然率大于或等于1×1012时，强有力支持两份样本的同一性，可认定两份样本的同一性，即两份样本属于同一马来穿山甲个体；似然率越大对同一性的支持强度越大；2当两份样本在所检测的16个基因座的STR分型，有1个以上位点不一致时，可排除两份样本的同一性，即两份样本属于不同的马来穿山甲个体；马来穿山甲样本的似然率计算过程如下：1分别对所有马来穿山甲个体样本的16个基因座进行STR复合扩增，扩增产物通过毛细管电泳检测获得STR分型图谱，统计所检测的每个基因座的每种等位基因分型的数量，进而计算每种等位基因分型在该基因座所有分型中的占比，即为该等位基因分型的等位基因频率，16个STR位点等位基因频率分布如表4所示：表4马来穿山甲16个STR分子标记等位基因频率分布表 2某个STR基因座的表型频率的计算方法为：设：某马来穿山甲样本的某个STR基因座的等位基因1的频率为p，等位基因2的频率为q；a若通过STR复合扩增、毛细管电泳检测所得数据显示该样本在该基因座为纯合子，即一对等位基因具有相同的分型，表型频率计算公式为：表型频率＝p2；b若通过STR复合扩增、毛细管电泳检测所得数据显示该样本在该基因座为杂合子，即一对等位基因具有不同的分型，表型频率计算公式为：表型频率＝2pq；c由于STR为共显性遗传标记，因此等位基因的表型频率和基因型频率一致；3所述个体识别的证据强度，即似然率的计算公式为：LR＝1PX其中PX代表表型组合X的组合概率；PX＝P1×P2×P3×…×PiPi为第i个基因座的表型频率，其是根据表4中的等位基因频率进行确定。

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