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一种球虫单个卵囊全基因组DNA扩增和基因组测序的方法 

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申请/专利权人:河南农业大学

摘要:本发明提供了一种球虫单个卵囊全基因组DNA扩增和基因组测序的方法,属于寄生虫检测技术领域,所述方法包括下列步骤:S1)纯化球虫卵囊;S2)单卵囊分离及卵囊壁破碎;S3)球虫全基因组DNA扩增;S4)全基因组扩增产物纯化;S5)WGA产物检测;S6)高通量测序分析。本发明利用显微镜和毛细管针精准地分离出单个球虫卵囊,保证了卵囊的纯度;在显微镜下,利用毛细管针刺破球虫卵囊壁,释放出四个孢子囊,未对球虫DNA链造成损伤;经过全基因组扩增获得高质量的扩增基因组,达到第二代及第三代测序要求,球虫基因组达到染色体草图级别且完整度在90%以上。

主权项:1.一种球虫单个卵囊全基因组DNA扩增和基因组测序的方法,其特征在于,所述方法包括下列步骤:S1)纯化球虫卵囊:取感染球虫的动物粪便,基于饱和盐水漂浮法和氯化铯梯度离心法进行球虫卵囊纯化,得到球虫卵囊液;S2)单卵囊分离及卵囊壁破碎:将纯化后的球虫卵囊液置于显微镜下,根据球虫形态结构确认目标球虫卵囊,使用毛细管针分离目标球虫卵囊,使用PBS缓冲液冲洗后并置于新的缓冲液中,在显微镜下使用毛细管针轻轻戳卵囊壁使其破壁,得到破碎的卵囊壁和释放出的4个孢子囊;使用毛细管针分离4个孢子囊并置于PBS缓冲液中;S3)球虫全基因组DNA扩增:使用单细胞全基因扩增方法对步骤S2)得到的4个孢子囊样品进行裂解及全基因组扩增,获得球虫全基因组DNA样本;S4)全基因组扩增产物纯化:使用商业化试剂AgcourtAMPureXP对步骤S3)中获得的球虫全基因组DNA样本进行磁珠纯化,得到纯化后的DNA样本;S5)WGA产物检测:对步骤S4)中纯化后的DNA样本采用0.8%琼脂糖凝胶脉冲电泳检测,确定扩增是否成功;使用NanoDropOne检测样品浓度C、A260A280及A260A230;使用Qubit对WGA产物进行定量,并根据两种仪器检测的浓度计算NcQc值;取1uL步骤S4)中纯化后的DNA样本用双蒸水按照1:100稀释,利用荧光定量PCR仪基于球虫SSUrRNA基因检测稀释液中球虫基因组DNA的含量;以反应测得的Ct值表征稀释液中柔嫩艾美耳球虫基因组DNA的含量;S6)高通量测序分析:对步骤S4)中纯化后DNA进行高通量文库构建及第三代PacBioRevioHiFi平台测序,测序数据使用blastn与NT库进行比对,去除污染及接头序列;使用flye软件和ragoo软件进行基因组组装,获得最终的基因组组装结果,并使用Busco软件基于coccidia_odb10数据库评估其完整性;通过MCScanX软件将球虫基因组与参考基因组进行共线性分析。

全文数据:

权利要求:

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