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申请/专利权人：云南农业大学
摘要：本发明涉及一种通过诱导性表达K‑Ras基因构建小型猪肿瘤模型的方法，通过Tet‑On诱导表达系统与转座子技术结合，构建Tet‑On转座子表达载体PB‑CAG‑Teton3g‑T2A‑mcherry‑TRE3GS‑MCS‑Puro。获得K‑Ras基因编辑阳性细胞细胞系，构建K‑Ras基因编辑克隆胚，并移植至代孕母猪输卵管内，生产K‑Ras基因编辑克隆猪个体，通过饲喂四环素诱导K‑Ras表达，促进克隆猪肿瘤的发生，获得小型猪肿瘤模型。本发明克服了现有模型构建周期长、效率低、表型不明显、基因表达可控性差等技术问题，实现批量K‑Ras基因诱导性表达小型猪肿瘤模型的生产，在肿瘤生物学研究领域具有重要的应用价值和前景。
主权项：1.一种构建K-Ras基因诱导性表达小型猪肿瘤模型的方法，其特征在于，所述方法包括：（1）将转座子诱导表达质粒经PCR转化至DH5α感受态菌中进行扩增，筛选得到PB-TMP-MCS目的质粒；所述转座子诱导表达质粒包括侧翼的PiggyBac反向末端重复序列、三个启动子和对应的polyA序列；（2）将（1）中筛选得到的PB-TMP-MCS目的质粒经限制性核酸内切酶切割，将体外合成的HA-kras系列克隆至MCS位置，并通过测序验证无误后命名为PB-TMP-HA-krasG12D；所述HA-kras的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:1所示；所述PB-TMP-HA-krasG12D的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:2所示；（3）将所述（2）中获得的PB-TMP-HA-krasG12D与转座酶通过电穿孔共转染至猪胎儿成纤维细胞系，经单细胞克隆筛选获得K-Ras基因编辑阳性猪胎儿成纤维细胞系；（4）将所述（3）中获得K-Ras基因编辑阳性猪胎儿成纤维细胞系为供体细胞进行体细胞核移植，构建K-Ras基因诱导性表达克隆胚，进一步将克隆胚移植至代孕母猪输卵管内，分娩获得K-Ras基因诱导性表达克隆猪。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 云南农业大学 一种通过诱导性表达K-Ras基因构建小型猪肿瘤模型的方法
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