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申请/专利权人：桂林医学院附属医院

摘要：本发明公开了一种基于RNA靶向结合位点的LncRNAXIST基因敲入动物模型构建方法，包括生物信息学分析XIST基因与mmu‑miR‑140‑5p靶向结合位点在XIST基因上第七个外显子、体外实验证实XIST基因与mmu‑miR‑140‑5p在生物信息学分析中的靶向结合位点、靶向小鼠XIST基因包含有靶向结合位点的第七个外显子的sgRNA载体构建、sgRNA的体外转录、F0代小鼠获取及鉴定、F1代杂合小鼠获取及鉴定、纯合后代的获取过程XIST基因敲入动物模型，解决了CRISPRCas9对于全长达到17.9kb，且含有七个外显子的XIST基因敲入过程中由于片段过长造成的基因脱靶率高的问题。

主权项：1.一种基于RNA靶向结合位点的LncRNAXIST基因敲入动物模型构建方法，其特征在于：包括如下步骤：1）使用starbase数据库进行生物信息学分析确认LncRNAXIST与microRNAmmu-miR-140-5p靶向结合位点信息；2）通过NCBI数据库比对上述靶向结合位点在LncRNAXIST基因的位置；3）通过NCBI数据库比对上述靶向结合位点在LncRNAXIST基因的第七个外显子；4）通过双荧光素酶基因报告系统在体外实验中证实上述数据库显示的LncRNAXIST与microRNAmmu-miR-140-5p靶向结合位点真实存在；5）LncRNAXIST全长17.9kb，根据其第七个外显子设计基于LncRNAXIST与microRNAsmmu-miR-140-5p靶向结合位点的LncRNAXIST基因敲入策略；所述的第七个外显子长度为7.6kb；6）通过敲入LncRNAXIST第七个外显子，实现LncRNAXIST基因的敲入；步骤5）是LncRNAXIST第七个外显子与mmu-miR-140-5p存在靶向结合，基于RNA靶向结合位点将原本应该敲入长度17.9kb的核酸片段缩短为长度7.6kb的核酸片段，有效降低LncRNAXIST敲入的脱靶率，具体包括以下步骤：①生物信息学分析发现LncRNAXIST与microRNAsmmu-miR-140-5p靶向结合位点碱基序列信息；②确定该结合位点碱基序列位于LncRNAXIST第七个外显子；③确定LncRNAXIST第七个外显子长度为7.6kb，相对于LncRNAXIST全长17.9kb极大地缩短；④体外实验双荧光素酶基因报告系统证实LncRNAXIST与microRNAmmu-miR-140-5p靶向结合位点真实存在。

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