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摘要：本发明公开了一种过表达TRIM40抑制胰腺癌细胞的增殖迁移侵袭及其应用，属于生物医学技术领域，该发明确认TRIM40在胰腺癌细胞中表达，发现其过表达能抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭，此发现为胰腺癌治疗提供新思路，可能成为精准且低副作用的治疗方式，本案还提出利用TRIM40过表达模型筛选基因治疗药物，为个性化治疗提供基础，此外，研究探讨了TRIM40对细胞周期的影响，揭示其在肿瘤发展中的作用机制，最后，提出利用此模型进行体外药物敏感性测试，快速筛选有效药物，缩短研发时间，降低成本，并为治疗方案选择提供准确依据，综上，本研究为胰腺癌提供新分子靶点和策略，为个性化治疗和药物研发提供实验基础和方法，有望提高患者生存率和生活质量。

主权项：1.一种过表达TRIM40抑制胰腺癌细胞的增殖迁移侵袭及其应用，该方法包括以下步骤：A.提供一种胰腺癌细胞株，例如MIAPaCa-2或PANC-1，添加了10％的胎牛血清和1％青霉素-链霉素的新鲜配制的DMEM培养基中培养，培养条件为37℃，5％CO2，培养至一定密度即80％左右后，取对数生长期的细胞进行后续的接种处理；B.构建稳转细胞株，取对数生长期的MIAPaCa-2细胞接种到24孔板中，37℃、5％CO2培养16-24h后，细胞汇合度约50-60％左右可进行感染，16h后进行换液，感染后72h可观察荧光强度并进行测定转染效率；C.qRT-PCR实验，用Trizol法提取总RNA，并使用反转录试剂盒Takara将其反转录为cDNA。qRT-PCR使用SYBRGreenqPCR法在PCR仪器中进行。以GAPDH为内参，使用2-ΔΔCt法计算相对表达水平；D.WesternBlot实验，收集生长状态良好的MIAPaCa-2和PANC-1细胞，加入RIPA裂解液提取蛋白，采用BCA试剂盒进行浓度测定及定量；将取出的SDS-PAGE凝胶于电泳槽固定，以总蛋白量为30ng上样，恒压160V、50min进行电泳。然后将分离后的蛋白质采用湿法进行转膜，将转膜后的PVDF膜在5％脱脂牛奶中室温封闭2h，用TBST10min次，洗三次，加入TRIM401：3000或GAPDH1：10000抗体中4℃缓慢孵育过夜；24h后取出膜用TBST洗三次，加入二抗1：10000室温摇床孵育2h，使用凝胶成像仪进行显影成像。E.免疫荧光实验，将PANC-1和MIAPaCa-2细胞铺板于免疫荧光小皿中央，培养24h后，用PBS洗5min，洗3次，多聚甲醛固定30min，再次用PBS洗，TritonX-100透化5min，PBS洗干净，5％BSA封闭2h后，加入用1％BSA配制的TRIM401：200抗体4℃过夜孵育；24h后用PBST洗净，避光孵育兔二抗1：5002h，PBST洗3次，DAPI避光染核5min，用PBST洗净，在共聚焦显微镜下观察TRIM40的表达和定位情况并拍照。F、细胞增殖实验，将处于对数生长期的细胞消化稀释，配制为1000个孔1x104ml的细胞悬液，以100ul孔接种到96孔板中，每组至少3个复孔，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养；48h后每孔加入10ul的CCK8试剂，于培养箱中避光孵育2h后，使用酶标仪在450nm波长处测定吸光度值，进行统计分析G、克隆形成实验，将处于对数生长期的细胞消化稀释，配制为1000个孔的细胞悬液，接种到六孔板中，于37℃、5％CO2的培养箱中培养，每间隔3天进行换液，连续培养14天。用PBS洗涤后多聚甲醛固定15min，1％的结晶紫染色15min，晾干后拍照；H、细胞划痕试验，将处于对数生长期的细胞消化稀释，配制3.5x104个孔的细胞悬液，吸取70ul均匀铺在伤口愈合插件里，待细胞汇合度为90％左右，拔下伤口愈合插件，PBS清洗，加入培养基，于0h和24h分别进行拍照；I、迁移实验：在Transwell小室的上室加入1x105个悬浮于100ul无血清培养基的细胞，下室加入600ul完全培养基。37℃、5％CO2的培养箱中培养48h后取出小室，PBS洗3次，4％多聚甲醛固定30min，1％的结晶紫染色5min，用湿棉签擦掉上室中未穿过来的细胞，并用PBS洗涤干净。在倒置显微镜下观察拍照并计数；J、侵袭实验：在Transwell上室膜预涂100ul基质胶，在37℃下静置2h，待其凝固后吸去多余基质胶。后续步骤同迁移实验；K、统计与分析，采用GraphPadPrism8.0软件进行统计分析，以均数±标准差表示，两组间比较采用配对t检验，P0.05为差异具有统计学意义。

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