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摘要：本发明公开了一种毛囊干细胞功能亚群规模化制备方法，属于生物技术领域。本发明公开的一种毛囊干细胞功能亚群规模化制备方法，优化人类毛囊干细胞HFSCs分化体系，获得iPSCs分化来源的HFSCs。该方法可源源不断获得生产工艺稳定、分化一致性高、增殖能力强的HFSCs细胞株。解决了毛囊数量局限、不可再生且操作繁琐的问题，为建立临床应用级别的人类毛囊干细胞HFSCs资源奠定了良好的技术基础。

主权项：1.一种毛囊干细胞功能亚群规模化制备方法，其特征在于，具体步骤如下：1建立非整合非病毒、无血清、培养基成分明确、无饲养层细胞的iPSCs细胞株；2iPSCs高效分化为HFSCs；步骤如下：1iPSCs细胞准备：利用Essential8TM培养基复苏非整合非病毒iPSCs至预先包被10μg玻连蛋白的6孔板中，至37℃二氧化碳培养箱培养至iPSCs细胞达到80％至90％的汇合度；2拟胚体培养：吸弃Essential8TM培养基，加入1ml不含Ca2+和Mg2+的D-PBS清洗1遍，3mlEssential8TM培养基重悬，手动将iPSCs集落分成小簇；使用P-1000移液枪上下吸移数次，以减小簇的大小，转入新的6孔板中，转移至37℃二氧化碳培养箱培养24小时；隔天在显微镜下检查EB形成情况，更换新的Essential8TM培养基，如此每天换液，重复操作2-4天；所述Essential8TM培养基含ROCK抑制剂“Y-27632”，1μlml；3诱导HFSCs：在显微镜下观察到明显拟胚体EB后，将EB收集在15ml锥形管中，去除上清液后，将EB移植到预包被48-96μg胶原酶I涂层的6孔板上，使用3mlHFSCs分化培养基①进行培养，每天换液，37℃二氧化碳培养箱培养3天；4HFSCs培养：按照HFSCs分化培养基①：HFSCs分化培养基②比例分别为3：1、1：1、1：3的方式每天换液，将培养基更换为HFSCs分化培养基②；之后继续每天换液，37℃二氧化碳培养箱培养5-7天可获得可移植的HFSCs细胞；5HFSCs鉴定：待诱导获得的HFSCs在显微镜下观察细胞汇合度在70％-80％时，利用TrypLETMExpress消化后收集HFSCs细胞，以1：2稀释比例转入新的6孔板，标记为passage1，然后转移至37℃二氧化碳培养箱继续培养；之后以不低于1：2的稀释比例传代至passage10，经过扩增后的HFSCs，包括但不限于以下鉴定，a细胞形态学鉴定；b角蛋白18、转录因子p63、角蛋白14、整合素β1免疫荧光染色鉴定HFSCs功能亚群；c角蛋白18、转录因子p63荧光染色传代稳定性鉴定。

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