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摘要：本发明公开了一种双孢菇营养液共培养高效转基因法，包括以下步骤：S1培养基的配制、S2转基因载体的构建、S3农杆菌的转化、S4双孢菇的准备、S5农杆菌的准备、S6侵染、S7筛选以及S8转基因结果检测；本发明为了提高双孢菇的转化效率，同时便于转基因材料的鉴别，构建了适用于双孢菇的转基因载体，该载体同时具备荧光筛选标签和抗性基因标签，可按照传统的方法，利用抗生素筛选转基因阳性材料，也可以在转基因过程中，随时观察荧光标签的表达情况，来确定转基因效果，同时采用PDA与PDB培养基，利用最常见的LBA4404农杆菌菌株，通过不断优化转化条件，获得了最佳的转化效果，整个方法操作简单，材料廉价易获取，转化效率高。

主权项：1.一种双孢菇营养液共培养高效转基因法，其特征在于，包括以下步骤：S1：配制培养基：包括PDA培养基的配制、PDB培养基的配制、液体LB培养基的配制、固体LB培养基的配制、以及悬浮液的配制；S2：构建转基因载体：通过克隆双孢菇酪氨酸酶基因的启动子，用于驱动潮霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因的表达，构建专用于双孢菇的转基因载体；S3：进行农杆菌转化：S301：将S2中测序结果正确的转基因载体，用20ml液体LB培养基，在37℃下过夜培养，再提取质粒；S302：用移液器吸取2ul质粒，加入农杆菌LBA4404感受态细胞中，按照冰浴5min，液氮冻存5min，37℃5min，冰浴5min的转化流程，将质粒转入农杆菌中；S303：加入500ulLB培养基，在28℃180rpm条件下，震荡培养1h；S304：取出菌液，8000rpm条件下离心1min，吸取并丢掉500ul上清液；S305：用移液器吹打重悬菌体，并将其涂在含有50mgL卡那抗性的LB平板上，在28℃下培养2天；S306：挑取单克隆菌落，用含有50mgL卡那霉素液体LB培养基培养，之后保存菌种备用；S4：预备双孢菇：在超净工作台内，用灭菌后的移液器吸头，挑取适量双孢菇的菌丝，加入到30mlPDB培养基中；在25℃，150rpm下，震荡培养，至菌丝直径3-5mm；将含双孢菇菌丝球的培养基在50ml的离心管中，在4000-5000rpm条件下离心10min，倒掉上清液，收集菌体；S5：预备农杆菌：用50ml离心管，先添加5mlLB培养基，加入S3中准备的农杆菌，在28℃180rpm条件下培养至浑浊；再取10mlLB培养基，按照1:100的比例稀释农杆菌，并在28℃180rpm条件下震荡培养至OD600介于0.4-0.6；在4000-5000rpm下，离心5-10min，收集农杆菌；按照原始菌液的体积加入等量悬浮液，用枪头吹打，重悬农杆菌；然后将该重悬液在室温下静置2-3h，充分活化；S6：侵染：将S4中的双孢蘑菇用适量PDB培养悬浮，再用灭菌过的药匙将菌丝球压成糊状；然后将S5中活化后的农杆菌加入双孢菇菌丝悬浮液中，并震荡混匀，使农杆菌与菌丝体充分接触，在室温黑暗条件下静置48h；S7：筛选：取适量PDB培养基，并添加一定体积的抗生素溶液，使其终浓度分别为头孢200ugml，潮霉素30ugml，特美汀250ugml；将S6中静置后的菌液，用抗性PDB培养基反复漂洗，只保留双孢菇菌丝；将漂洗后的菌丝在25℃150rpm条件下培养，长出新的菌丝球后，即可在蓝光下进行筛选；S8：转基因结果检测：包括手持灯观察、荧光显微镜观察和阳性材料eGFP克隆检测。

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