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申请/专利权人：中国医学科学院医学实验动物研究所;吉林大学

摘要：本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种引物组及其在扩增SIVSHIV基因组的中的应用与试剂盒。本发明提供的引物组能够具有特异性的、稳定而准确的扩增出目标序列。经琼脂糖凝胶电泳检测，未见非特异性条带产生，未见拖尾或弥散现象产生。经测序后与Genbank中登录的SIVmac239全基因组序列比对，匹配度为100％，未见碱基置换或缺失gap。实验表明，本发明提供的引物组对SIVSHIV基因组具有良好的灵敏性，在病毒拷贝数为100.5～1.0之间皆能起到良好的检测效果，分析认为灵敏性的差异性与病毒序列变异度有关。

主权项：一种引物组，其特征在于，包括SEQ ID NO:1～4所示核苷酸序列的4条引物和或SEQ ID NO:5～8所示核苷酸序列的4条引物。

全文数据：一种引物组及其在扩増SIVSHIV基因组中的应用与试剂盒技术领域[0001]本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种引物组及其在扩增SIVSHIV基因组中的应用与试剂盒。背景技术[0002]艾滋病，又称为获得性免疫缺陷综合症（AcquiredImmuneDeficiencySyndrome，AIDS是由人类免疫缺陷病毒Humanimmunodeficiencyvirus，HIV引起的一类死亡率极高的传染性疾病，对全球、尤其是亚洲和非洲等广大发展中国家人民的生命健康安全威胁极大。HIV最独特的特征之一就是基因组的高变异性。基于基因变异，流行于全球的HIV-I分为四组，M组、0组、N组和P组，M组内又可分为A〜J10个亚型，各亚型间的基因离散率是20%〜35%，同时，还有数十种循环重组型存在。病毒基因组基因分析在HIV研究的很多重大发现中扮演了重要角色，而且高水平的基因变异分析也是艾滋病广谱疫苗研发的重要障碍。因此，高水平的病毒基因获取技术对HIV研究至关重要。[0003]SIVSimianimmunodeficiencyvirus是一种猴免疫缺陷病毒，发现于非洲灵长类动物，与HIV-1病毒非常相似。SHIVSimian-Humanimmunodeficiencyvirus是人猿嵌合免疫缺陷病毒，是应用分子生物学技术将HIV-I重要基因与SIV重组成的嵌合体病毒。由于恒河猴感染SIV和人感染HIV-I存在着相似性，继而发展出的症状也和AIDS相似，这些特点可以使SIV恒河猴动物模型用于HIVAIDS研究。因此，SIV、SHIV病毒基因组序列的获得及分析就显得尤为重要。[0004]起初，人们使用普通PCRBulkPCR扩增早期血浆病毒以获得SIV或SHIV病毒的基因组片段，然后进行Sanger测序。该方法具有简单、易操作及成本低等优势，也得到了急性期和早期病毒群体的大概复杂性。但是，由于SIV病毒或SHIV病毒的基因组序列长度较长，约为lOOOObp，普通的PCR技术往往存在重组、序列选择及扩增序列有限的问题，这就使扩增所获得的片段会产生一定的突变，降低了精确度，给后续序列分析造成困扰。[0005]因此，需要进一步研究能够精确扩增SIV或SHIV病毒基因组的引物。发明内容[0006]有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种引物组及其在扩增SIVSHIV基因组中的应用与试剂盒，本发明提供的引物特异性好，精确度高、敏感性高。[0007]本发明提供的引物组包括SEQIDNO:1〜4所示核苷酸序列的4条引物和SseqIDNO:5〜8所示核苷酸序列的4条引物。[0008]本发明提供的引物组在扩增SIVSHIV基因组的中的应用。[0009]本发明提供的引物组根据SIVmac239全基因组序列®enbankNO.M33262保守区设计，分别位于LTR和Pol区。其中，SEQIDN0:1〜4所示核苷酸序列的4条引物用于扩增SIVSHIV基因组的5’半长基因组全长的509位〜6236位，共计5728bp，SEQIDNO:5〜8所示核苷酸序列的4条引物用于扩增SIVSHIV基因组的3’半长基因组全长的5244位〜10087位，共计4844bp。以本发明提供引物组扩增得到的5’半长和3’半长存在重复序列，经测序后能够拼接获得完整的SIVmac239全基因组序列。[0010]本发明提供的引物组能够具有特异性的、稳定而准确的扩增出目标序列。经琼脂糖凝胶电泳检测，未见非特异性条带产生，未见拖尾或弥散现象产生。经测序后与Genbank中登录的SIVmac239全基因组序列比对，匹配度为100%，未见碱基置换或缺失gap。[0011]实验表明，本发明提供的引物组对SIVSHIV基因组具有良好的灵敏性，在病毒拷贝数为之间皆能起到良好的检测效果，分析认为灵敏性的差异性与病毒序列变异度有关。[0012]本发明还提供了扩增SIVSHIV基因组的试剂盒，包括本发明提供的的引物组。[0013]本发明提供的引物组以质粒DNA为模板，也可以动物血浆逆转录来的病毒cDNA为模板。作为优选，以病毒cDNA为模板。因此，需提取病毒RNA逆转录制备cDNA。[00M]本发明提供的试剂盒中还包括SEQIDN0:9所示核苷酸序列的逆转录引物。[0015]本发明提供的试剂盒中还包括SuperscriptIII酶和HighFidelityTaq酶。[0016]其中，SuperscriptIII酶为逆转录酶。[0017]本发明提供的试剂盒中还包括巢式PCR常用的缓冲液、底物，例如:PCRbuffer、Mg2+、dNTP〇[0018]本发明提供了扩增SIVSHIV基因组的方法，其特征在于，包括：以待测样品的cDNA为模板，以本发明提供的引物组扩增。[0019]在本发明实施例中，扩增采用巢式PCR分别扩增SIVSHIV基因组的5’半长、3’半长。[0020]本发明中SIVSHIV基因组的5’半长的扩增包括：[0021]步骤1:以待测样品的cDNA为模板，以SEQIDNO:1〜2所示核苷酸序列的引物扩增，获得中间产物；[0022]步骤2:以中间产物为模板，以SEQIDNO:3〜4所示核苷酸序列的引物扩增，获得SIVSHIV基因组的5’半长。[0023]退火温度AnnealingTemperature为引物和模板结合时候的温度参数，当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度，它是影响PCR特异性的较重要因素。[0024]作为优选，步骤1中扩增的退火温度为60°C〜62°C，步骤2中扩增的退火温度为60cC。[0025]优选的，步骤1中的扩增程序为：[0026][0027]或[0028][0029][0030]优选的，步骤1中的扩增体系为：[0031][0032]优选的，步骤2中的扩增程序为：[0033][0034]优选的，步骤2中的扩增体系为：[0035][0036]在本发明中，SIVSHIV基因组的3’半长的扩增包括：[0037]步骤1:以待测样品的cDNA为模板，以SEQIDNO:5〜6所示核苷酸序列的引物扩增，获得中间产物；[0038]步骤2:以所述中间产物为模板，以SEQIDN0:7〜8所示核苷酸序列的引物扩增，获得SIVSHIV基因组的3’半长。[0039]作为优选，步骤1中扩增的退火温度为64°C，步骤2中扩增的退火温度为60°C。[0040]优选的，步骤1中的扩增程序为：[0041][0042]优选的，步骤1中的扩增体系为：[0043][0044]优选的，步骤2中的扩增程序为：[0045；[0046]优选的，步骤2中的扩增体系为：[0047][0048]在本发明中待测样品为血浆、组织、细胞或质粒。[0049]本发明提供了用于扩增SIVSHIV基因组的引物组，该引物组能够有效扩增SIV或SHIV的基因组。本发明提供的引物组能够具有特异性的、稳定而准确的扩增出目标序列。经琼脂糖凝胶电泳检测，未见非特异性条带产生，未见拖尾或弥散现象产生。经测序后与Genbank中登录的SIVmac239全基因组序列比对，匹配度为100%，未见碱基置换或缺失gap。实验表明，本发明提供的引物组对SIVSHIV基因组具有良好的灵敏性，在病毒拷贝数为之间皆能起到良好的检测效果，分析认为灵敏性的差异性与病毒序列变异度有关。附图说明[0050]图1示实施例1扩增产物的电泳图；其中，泳道1〜8依次示引物对1〜8的扩增效果，泳道W示以水为阴性对照的电泳，泳道M示marker;[0051]图2-a示实施例2各组引物以SIVmac239质粒为模板扩增产物3’半长）的电泳图；其中泳道1〜5依次示对照组1〜5引物的扩增效果;泳道6示实验组1引物的扩增效果;泳道N示阴性对照，泳道P示阳性对照，泳道M示marker;[0052]图2-b示实施例示表2各组引物以SIVmac239质粒为模板扩增产物5’半长）的电泳图；其中泳道1〜2依次示对照组6〜7引物的扩增效果;泳道3示实验组2引物的扩增效果;泳道4〜6示对照组8〜10引物的扩增效果；泳道N示阴性对照，泳道P示阳性对照，泳道M示marker；[0053]图3-a示表2各组引物以SHIV-KB9质粒为模板扩增产物3’半长的电泳图；其中泳道1〜5依次示对照组1〜5引物的扩增效果;泳道6示实验组1引物的扩增效果;泳道N示阴性对照，泳道P示阳性对照，泳道M示marker;[0054]图3-b示表2各组引物以SHIV-KB9质粒为模板扩增产物5’半长的电泳图；其中泳道1〜2依次示对照组6〜7引物的扩增效果;泳道3示实验组2引物的扩增效果;泳道4〜6示对照组8〜10引物的扩增效果;泳道N示阴性对照，泳道P示阳性对照，泳道M示marker;[0055]图4-a示表2实验组2引物对的退火温度检测；泳道N示阴性对照，泳道P示阳性对照，泳道M示marker;[0056]图4-b示表2实验组1引物对的退火温度检测；泳道M示以SIVmac239质粒为模板;泳道K示以SHIV-KB9质粒为模板;泳道N示阴性对照，泳道P示阳性对照，泳道Mr示marker;[0057]图5-a示以实验组2的引物组扩增不同模板的扩增效果，SI〜S9示以不同毒株感染的细胞上清为模板的编号，其中，Sl为SIVmac239感染的细胞上清为模板，S2为SIVmac239-973感染的细胞上清为模板，S3为SIVmac251感染的细胞上清为模板，S3为SHIV-CN97001感染的细胞上清为模板，S4为SHIV-chnl9P7感染的细胞上清为模板，S5为SHIV-KB9感染的细胞上清为模板，S6为SHIV-162P3感染的细胞上清为模板，S7为SHIV-162P4感染的细胞上清为模板，S8为SHIV-1157ipd3N4感染的细胞上清为模板，S9为RT-SHIV.感染的细胞上清为模板；[0058]图5-b示以实验组1的引物组扩增不同模板的扩增效果，Sl〜S9示以不同毒株感染的细胞上清为模板的编号，其中，Sl为SIVmac239感染的细胞上清为模板，S2为SIVmac239-973感染的细胞上清为模板，S3为SIVmac251感染的细胞上清为模板，S3为SHIV-CN97001感染的细胞上清为模板，S4为SHIV-chnl9P7感染的细胞上清为模板，S5为SHIV-KB9感染的细胞上清为模板，S6为SHIV-162P3感染的细胞上清为模板，S7为SHIV-162P4感染的细胞上清为模板，S8为SHIV-1157ipd3N4感染的细胞上清为模板，S9为RT-SHIV.感染的细胞上清为模板；[0059]图6-a示以感染SIV的猴血浆为模板，以本发明提供的引物组扩增产物3’半长电泳图；[0060]图6-b示以感染SIV的猴血浆为模板，以本发明提供的引物组扩增产物5’半长电泳图。具体实施方式[0061]本发明提供了一种引物组及其在扩增SIVSHIV基因组中的应用与试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。[0062]本发明采用的酶、试剂或仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。[0063]本发明所用的质粒SIVmac239中包含SIV基因组的序列，SHIV-KB9中包含SHIV的基因组序列。本发明所采用的SIVSHIV感染猴血清由中国医学科学院医学实验动物研究所采集分离。[0064]下面结合实施例，进一步阐述本发明：[0065]实施例1[0066]以SIVmac239质粒为模板，以表1记载的引物扩增。[0067]表1引物序列[0069]扩增体系为：[0071]扩增程序为：[0074]扩增产物经1.2%TAE琼脂糖凝胶电泳，结果如图I，其中，泳道1〜8依次示引物对I〜8的扩增效果，泳道W示以水为阴性对照的电泳，泳道M示marker。如图所示，所得产物未见非特异性条带，未见弥散或拖尾现象。说明使用上述引物对扩增SIVmac239质粒，能够得到预期长度的PCR片段，8对引物对的特异性良好，扩增效率高，可用于病毒序列扩增。[0075]实施例2[0076]采用表2引物，以巢式PCR的方式扩增，第一轮扩增以SIVmac239培养上清为模板，第二轮扩增以第一轮的扩增产物为模板。实验设置2个实验组分别扩增基因组的3’半长和5’半长。另设10个对比组。[0077]表2引物序列[0082]扩增程序为：[0084]各组实验经两轮PCR扩增所得产物经1.2%TAE琼脂糖凝胶电泳，结果如图2-a和图2-b。由图可知，实验组1提供的引物对最适用于扩增SIV基因组的5’端，而实验组2提供的引物最适宜用于扩增SIV基因组的3’端。其他引物在扩增时往往易产生非特异性条带。[0085]将实验组1提供引物扩增得到的5’半长与实验组2提供的引物扩增得到的3’半长的扩增产物使用QiagenPCR存化试剂盒存化PCR产物，使用深度测序测定PCR产物序列。所有获得的序列使用Sequencher软件测序，进一步的分析使用CLUSTALW和MASE软件。实验组1和实验组2所提供的引物经巢式PCR后，所得扩增产物纯化后测序，序列与genbank上的SIVmac239序列GenbankNO.M33262进行比对，比对结果显示，扩增序列与参考序列完全一致，未见碱基的置换或缺失。且扩增片段中未见宿主基因组序列。[0086]实施例3[0087]采用实施例2中表2引物，以巢式PCR的方式扩增，第一轮扩增以SIVmac239质粒为模板，第二轮扩增以第一轮的扩增产物为模板。实验设置2个实验组分别扩增基因组的3’半长和5’半长。另设10个对比组。[0088]扩增体系为：[0090]扩增程序为：[0092]各组实验经两轮PCR扩增所得产物经1.2%TAE琼脂糖凝胶电泳，结果如图3-a和图3-b。由图可知，实验组1提供的引物对最适用于扩增SIV基因组的5’端，而实验组2提供的引物最适宜用于扩增SIV基因组的3’端。对照组引物在扩增时往往易产生非特异性条带。[0093]将实验组1提供引物扩增得到的5’半长与实验组2提供的引物扩增得到的3’半长的扩增产物使用QiagenPCR存化试剂盒存化PCR产物，使用深度测序测定PCR产物序列。所有获得的序列使用Sequencher软件测序，进一步的分析使用CLUSTALW和MASE软件。实验组1和实验组2所提供的引物经巢式PCR后，所得扩增产物纯化后测序，序列与genbank上的SIVmac239序列GenbankNO.M33262进行比对，比对结果显示，扩增序列与参考序列完全一致，未见碱基的置换或缺失。且扩增片段中未见宿主基因组序列。[0094]实施例4[0095]以SIVmac239和SHIV-KB9病毒为模板，进行巢式PCR扩增。[0096]取实施例2表2中记载的实验组2的引物对，考察退火温度。结果如图4-a。结果说明，第1轮的最佳退火温度是64°C，第2轮的最佳退火温度是60°C。[0097]取实施例2表2中记载的实验组1的引物对，考察退火温度。结果如图4-b。结果说明，第1轮的最佳退火温度是60〜62°C，第2轮的最佳退火温度是60°C。[0098]实施例5[0099]将SIV病毒和SHIV病毒分别经10倍梯度稀释，浓度梯度为104、1〇-2、1〇-3、1〇-4。分别以本发明提供的实验组1和实验组2的引物对进行扩增，获得浓度的有效范围。判断方法的敏感性。结果如图5-a〜图5-b。结果显示，本发明提供的引物组在模板浓度为之间有效。[0100]实施例6[0101]以实施例2表2实验组1和实验组2的引物扩增感染SIV的猴血浆样品，结果如图6-a〜图6-b。结果显示，本发明提供的引物组能够成功扩增SIV病毒的全基因组，且不会产生非特异性条带。[0102]以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

权利要求：1.一种引物组，其特征在于，包括由SEQIDNO:1〜4所示核苷酸序列组成的4条引物和或由SEQIDNO:5〜8所示核苷酸序列组成的4条引物。2.权利要求1所述的引物组在制备扩增SIVSHIV基因组的试剂中的应用。3.—种扩增SIVSHIV基因组的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括由SEQIDNO:9所示核苷酸序列组成的逆转录引物。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括SuperscriptIII酶和HighFidelityTaq酶。6.非治疗与诊断目的的扩增SIVSHIV基因组的方法，其特征在于，包括：以待测样品的cDNA为模板，以权利要求1所述的引物组扩增。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增采用巢式PCR分别扩增SIVSHIV基因组的5’半长、3’半长。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述SIVSHIV基因组的5’半长的扩增包括：步骤1:以待测样品的cDNA为模板，以SEQIDN0:1〜2所示核苷酸序列的引物扩增，获得中间产物；步骤2:以所述中间产物为模板，以SEQIDNO:3〜4所示核苷酸序列的引物扩增，获得SIVSHIV基因组的5’半长。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述SIVSHIV基因组的3’半长的扩增包括：步骤1:以待测样品的cDNA为模板，以SEQIDN0:5〜6所示核苷酸序列的引物扩增，获得中间产物；步骤2:以所述中间产物为模板，以SEQIDNO:7〜8所示核苷酸序列的引物扩增，获得SIVSHIV基因组的3’半长。10.根据权利要求6〜9任一项所述的方法，其特征在于，所述待测样品为血浆、组织、细胞或质粒。

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