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申请/专利权人：北京农学院

摘要：本发明公开了RhoA重组蛋白在制备提高胚胎抗冻性以及解冻后复苏率的培养液中的应用。研究发现，在小鼠正常孵化胚胎的培养液中添加体外重组RhoA蛋白与对照组相比能够显著提高正常孵化胚胎的解冻复苏率。本发明将RhoA重组蛋白首次应用于胚胎冷冻领域，通过RhoA重组蛋白的添加显著提高胚胎的抗冻性以及解冻后的复苏率，一定程度上减少了有毒冷冻保护剂的使用，从而降低了对胚胎的不利影响，RhoA重组蛋白在胚胎的冷冻保存技术领域将具有广泛的应用前景。

主权项：RhoA重组蛋白在制备提高胚胎抗冻性以及解冻后复苏率的培养液中的应用。

全文数据：RhoA重组蛋白在制备提高胚胎抗冻性以及解冻后复苏率的培养液中的应用技术领域[0001]本发明涉及RhoA重组蛋白的新用途，特别涉及RhoA重组蛋白在制备提高胚胎抗冻性以及解冻后复苏率的培养液中的应用，本发明属于胚胎冷冻保存技术领域。背景技术[0002]在家畜繁殖领域中，胚胎冷冻保存技术等方面发展迅速，在畜牧业中，通过对冷冻保存的囊胚进行解冻，之后在适当的时间移植到受体母畜中已成为一种十分普遍的操作方法。到目前为止，实际生产过程中采用进口的聚乙二醇作为冷冻液的使用已经在实际的冷冻应用中起到了较好的效果。但是胚胎经过过冷冻后40%都会在冷冻过程中受到损伤，使得胚胎在移植后的成活率降低，而且这些冷冻液仍会给胚胎带来或多或少的毒性及危害。[0003]因此，开发出一种可提高胚胎的抗冻性以及解冻后的复苏率的方法是目前十分迫切的需要。[0004]本发明通过体外培养液中添加一定RhoA体外重组蛋白，胚胎培养6h后经过程序化冷冻后观察其解冻复苏率，希望能够从中找出一种毒性低且能够提高胚胎抗冻机能的物质，从而应用在家畜胚胎冷冻行业。发明内容[0005]本发明的目的在于提供RhoA重组蛋白在制备提高胚胎抗冻性以及解冻后复苏率的培养液中的应用。[0006]为了达到上述目的，本发明所采用的技术手段为：[0007]本发明通过在试验中添加体外重组的RhoA蛋白进行胚胎的体外培养，探索这种体外重组的RhoA蛋白是否使小鼠胚胎抗冻性提高，从而是否可以将其应用在规模化的胚胎冷冻领域。研究发现，在小鼠正常孵化胚胎的培养液中添加体外重组RhoA蛋白与对照组相比能够显著提高正常孵化胚胎的解冻复苏率P〈0.05。在Y-27632中培养2h后再放到RhoA体外重组蛋白中培养6h后进行冷冻，解冻复苏后结果与对照组相比极显著的降低。说明RhoA重组蛋白不能够使Y-27632对于胚胎的损伤可逆。以上研究证明：体外添加重组的RhoA蛋白可以显著提高正常孵化胚胎的解冻复苏率。[0008]在此研究的基础上，本发明提出了RhoA重组蛋白在制备提高胚胎抗冻性以及解冻后复苏率的培养液中的应用。[0009]在本发明中，优选的，所述的RhoA重组蛋白为人源RhoA重组蛋白，其genebank登录号为Accession:ΝΡ_001655·1。[0010]进一步的，本发明还提出了一种提高胚胎抗冻性以及解冻后复苏率的培养方法，其特征在于包括向胚胎培养液中加入RhoA重组蛋白。[0011]其中，优选的，所加入的RhoA重组蛋白在培养液中的终浓度为lygμΐ。[0012]其中，优选的，所述的培养方法包括以下步骤：[0013]获取的正常孵化胚胎用CZB溶液清洗3次，之后再进行体外培养，具体为在37°C、5%的CO2空气和100%湿度条件下，用四孔板进行体外培养，且分别向培养液中添加RhoA重组蛋白，使其终浓度为lygμΐ，经过体外培养6h后将胚胎进行程序化冷冻，解冻复苏后再放入平衡过的新CZB溶液中进行24h的复苏。[0014]相较于现有技术，本发明的有益效果在于：[0015]1、将RhoA重组蛋白首次应用于胚胎冷冻领域，通过RhoA重组蛋白的添加显著提高胚胎的抗冻性以及解冻后的复苏率；[0016]2、通过在含RhoA重组蛋白的培养液中培养，一定程度上增强了胚胎在冷冻过程中的抗低温能力，减少其在冷冻过程中受到的损伤，从而降低了冷冻过程对胚胎的不利影响。[0017]3、将RhoA重组蛋白直接添加到即将要冷冻胚胎的培养液中，增强其抗低温损伤的能力。附图说明[0018]图1为添加抑制剂及重组蛋白后对小鼠正常解冻复苏率的影响；[0019]图2为正常孵化胚胎在冷冻前、添加或不添加人源体外重组RhoA蛋白冷冻后Oh、添加或不添加人源体外重组RhoA蛋白冷冻后24h后的图；[0020]其中，1〜3图分别为正常孵化胚胎的冷冻前、不添加人源体外重组RhoA蛋白冷冻后Oh、不添加人源体外重组RhoA蛋白冷冻后24h，4〜6图分别为正常孵化胚胎的冷冻前、添加人源体外重组RhoA蛋白冷冻后Oh、添加人源体外重组RhoA蛋白冷冻后24h。具体实施方式[0021]下面结合具体实施例来和附图进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚"但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制"本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。[0022]实施例1[0023]1、材料[0024]1.1主要仪器和设备[0025]移液器:北京百晶移液器lmL、200yL、lOOyL、IOyL[0026]医用离心机:北京医用离心机厂，LDZ4-0.8[0027]CO2培养箱：HealForce公司，HF90[0028]体视显微镜:江南显微镜厂，Xl1-3[0029]超净工作台：上海智城分析仪器制造有限公司，ZHJH-1112B[0030]电子天平:北京赛多利斯仪器系统有限公司，BS124S[0031]酸度计：Thermo公司，868[0032]精密加热板：贝达仪器公司，MEH-2[0033]水浴锅:北京长安科学仪器厂，HH·Sl-Ni[0034]1.2主要试剂[0035]1·2·1人源体外重组RhoA蛋白，购自SinoBiological公司，货号：12441-H07B。[0036]1.2.2配重组蛋白体外培养液:在50yg的体外重组蛋白配成IOygAU的储液。保存在4。。。[0037]1.2.3培养液配制CZB储液）：[0039]注:A、B液分别充分溶解后，混勾，加水至250mL，0.22μπι滤器过滤，4°C保存1月。[0040]1.2.4Y-27632溶液的配制[0041]Y-27632的白色粉末配成20ymoll的储液。[0042]1·3试验材料[0043]本实验选用8〜12周龄性成熟，体重为28g左右的ICR系小鼠，购自北京维通利华实验动物科技有限公司。[0044]2、方法[0045]2.1小鼠的休眠获取与收集[0046]选择阴门淡粉色的雌性鼠，腹腔注射注射用血促性素PMSGIOIU只，48h后注射人绒毛膜促性腺激素hCGIOIU只，之后立即与成年公鼠1:1合笼过夜交配，次日早8点检查交配情况，见阴道栓后注射抗孕马血清A-PMSGIOIU只，[0047]获取的正常孵化胚胎用CZB清洗3次，之后再进行体外培养，具体为在37°C、5%的CO2空气和100%湿度条件下，用进口四孔板进行体外培养，且分别向CZB培养液中添加人源RhoA重组蛋白（终浓度为IygAU或Y-27632终浓度为2ym〇lL或在添加Y-27632终浓度为2μπιο11中培养2h后再放到添加人源RhoA体外重组蛋白（终浓度为IygAU中培养6h，同时设不另添加任何抑制剂的培养液作为对照组。经过体外培养6h后分别将各组胚胎进行程序化冷冻，解冻复苏后再放入平衡过的新CZB培养液中进行24h的复苏。24h后统计其解冻复苏率。[0048]2.2程序化冷冻[0049]将获得的胚胎用PBS清洗两遍，然后用梯度浓度逐渐脱去PBS再放到冷冻液中清洗两遍，然后装管。将获得得胚胎用PBS清洗两遍，然后依次过液A液：13冷冻液+23PBS，B液：12冷冻液+12TOS，C液:23冷冻液+13TOS，再放到冷冻液中清洗两遍，然后装管。用0.25ml的塑料细管按顺序吸入。冷冻液3cm—空气0.5cm—冷冻液3cm—空气0.5cm—含有胚胎的冷冻液3cm—空气0.5cm—冷冻液3cm—空气0.5cm—冷冻液3cm冷冻仪放入液氮，把装好的麦管放入冷冻仪中，以rCmin得速度降到-5°C时，平衡lOmin，然后用预冷的镊子夹住装有胚胎的麦管上端的冷冻液处3〜5s出现冰晶植冰完成，再平衡lOmin，然后以0.3°Cmin的速度直至降到-35°C。解冻时把冷冻细管从液氮中取出，在室温下轻轻晃动5s〜IOs后，投入到35°C水中IOs取出。剪掉麦管两端的栓部，将细管里的胚胎置于含有I.OML蔗糖溶液的表面皿中，按三步法脱去冷冻液。[0050]3、数据分析[0051]所有实验数据用SAS9.O统计软件进行单因素方差显著性。数据分析图为GraphPad软件制作。[0052]4、结果[0053]4.1培养液中添加不同抑制剂后对小鼠正常孵化胚胎解冻复苏率的影响[0054]结果如下表1及图1所示：[0055]表1添加不同抑制剂后培养囊胚的解冻复苏率（％[0057]注:数值表示方式为mean土SD。每个处理组中不同的大写字母之间显示为极显著P〈0.01;不同的小写字母之间表示为显著P〈0.05;不标为不显著P0.05。[0058]重复组为3组。[0059]4.2RhoA重组蛋白对于正常孵化胚胎冷冻以及解冻复苏后形态的影响[0060]图2为正常孵化胚胎在冷冻前、添加或不添加人源体外重组RhoA蛋白冷冻后Oh、添加或不添加人源体外重组RhoA蛋白冷冻后24h后的图；其中，1〜3图分别为正常孵化胚胎的冷冻前、不添加人源体外重组RhoA蛋白冷冻后Oh、不添加人源体外重组RhoA蛋白冷冻后24h，4〜6图分别为正常孵化胚胎的冷冻前、添加人源体外重组RhoA蛋白冷冻后Oh、添加人源体外重组RhoA蛋白冷冻后24h。[0061]以上结果表明：在小鼠正常孵化胚胎中添加体外重组RhoA蛋白与对照组相比能够显著提高正常囊胚的解冻复苏率P〈〇.〇5。在Y-27632中培养2h后再放到RhoA体外重组蛋白中培养6h后进行冷冻，解冻复苏后结果与对照组相比极显著的降低。说明RhoA重组蛋白不能够使Y-27632对于胚胎的损伤可逆。以上实验证明：体外添加重组的RhoA蛋白可以显著提高正常孵化胚胎的解冻复苏率。

权利要求：1.RhoA重组蛋白在制备提高胚胎抗冻性以及解冻后复苏率的培养液中的应用，所述胚胎不包括人类胚胎。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的RhoA重组蛋白为人源RhoA重组蛋白，其genebank登录号为Accession:ΝΡ_001655·1〇3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的胚胎为正常孵化胚胎。4.一种提高胚胎抗冻性以及解冻后复苏率的培养方法，其特征在于包括向胚胎培养液中加入RhoA重组蛋白，所述胚胎不包括人类胚胎。5.如权利要求4所述的培养方法，其特征在于所加入的RhoA重组蛋白在培养液中的终浓度为iygμΐ。6.如权利要求5所述的培养方法，其特征在于包括以下步骤：获取的正常孵化胚胎用CZB溶液清洗3次，之后再进行体外培养，具体为在37°C、5%的CO2空气和100%湿度条件下，用四孔板进行体外培养，且分别向培养液中添加RhoA重组蛋白，使其终浓度为lygμΐ，经过体外培养6h后将胚胎进行程序化冷冻，解冻复苏后再放入平衡过的新CZB溶液中进行24h的复苏。

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