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申请/专利权人：海南大学

摘要：本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测羊吕氏泰勒虫的荧光定量PCR检测引物、试剂及检测方法。该PCR引物的上游引物如SEQIDNO:1所示，下游引物如SEQIDNO:2所示。本发明所述引物特异性强、灵敏度高、扩增假阳性率低，可实现吕氏泰勒虫的快速、精准检测。

主权项：1.一种PCR引物，其特征在于，其上游引物如SEQIDNO:1所示，下游引物如SEQIDNO:2所示。

全文数据：一种用于检测羊吕氏泰勒虫的PCR引物、检测试剂及检测方法技术领域本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种用于检测羊吕氏泰勒虫的实时荧光PCR引物、检测试剂及检测方法。背景技术吕氏泰勒虫是以血蜱为传播媒介的，寄生于绵羊和山羊等动物的巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内的泰勒科泰勒属的一种血液性原虫。可引起羊泰勒虫病，该病在我国广泛分布，尤其是我国北方地区，主要呈地方性流行，能引起绵羊和山羊的大批死亡，给我国养羊业造成重大的经济损失。其畜牧业的危害较大。病羊通常存在个体消瘦，精神萎靡，体表淋巴结肩前和腹股沟浅淋巴结普遍肿大，触摸时有痛感。可视粘膜或薄软皮肤处都可能伴随有出血点，高热等症状。血涂片检查能检测到大量的梨形虫体和裂殖体。目前，吕氏泰勒虫的临床诊断主要的方法是直接镜检、血清学诊断酶联免疫吸附实验和间接免疫荧光试验和常规PCR检测等。直接镜检只能用于对发病动物的检测，且对操作者的经验要求高，并且不便于对疫情的普查；血清学诊断存在假阳性的问题。常规PCR检测技术虽然较为常用，但也存在灵敏性较低，易出现漏检的现象。SYBRGreenI实时荧光PCR使用一对特异性引物和SYBRGreenI核酸染料，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，无需电泳，实现快速灵敏地定量检测的目的。但目前缺乏特异性检测羊吕氏泰勒虫的实时荧光定量PCR引物。发明内容针对现有PCR检测技术特异性低和灵敏性低，吕氏泰勒虫含量较低时容易漏检的缺陷，本发明提供了用于检测羊吕氏泰勒虫的PCR引物、检测试剂及检测方法。该PCR引物及检测方法特异性强、敏感性高、漏检率低，可实现吕氏泰勒虫的快速、精准检测。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供一种用于羊吕氏泰勒虫的SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测引物，其上游引物如SEQIDNO:1所示，下游引物如SEQIDNO:2所示。本申请选择吕氏泰勒虫18SrDNA基因的一段特异性区域作为靶序列，设计了2条特异性引物，T.lu-18s-RT-F：5＇-CCAGCTCCAATAGCGTAT-3＇如SEQIDNO:1所示，T.lu-18s-RT-R：5′-AAGCCACAATACACCAAC-3＇如SEQIDNO:2所示，扩增的目标片段长103bp。与公开专利中提及的环形泰勒虫引物相比，该引物能特异性扩增吕氏泰勒虫片段，而不能检测出环形泰勒虫，具有较好的特异性；与吕氏泰勒虫其它区域设计的引物相比，尽管二者都可以检测到吕氏泰勒虫，但是本发明引物灵敏度更高。实验表明，该PCR引物与其他区域设计的引物相比具有特异性强、敏感性高、漏检率低的优势。其中，18SrDNA基因即编码18S核糖体RNArRNA分子的基因。本发明还提供了所述PCR引物在制备羊吕氏泰勒虫的检测试剂中的应用。其中，所述检测试剂为实时荧光检测试剂。本发明还提供了用于检测羊吕氏泰勒虫的实时荧光检测试剂，包括上述PCR引物。一些实施方案中，所述实时荧光检测试剂还包括FastStartTaqDNA聚合酶、dNTPs、反应缓冲液、SYBRGreenI荧光染料和水。一些实施方案中，所述实时荧光检测试剂还包括阴性对照品和阳性对照品；所述阴性对照品为水，所述阳性对照品为包含羊吕氏泰勒虫18SrRNA基因的重组质粒。本发明还提供一种羊吕氏泰勒虫的检测方法，用所述PCR引物对羊吕氏泰勒虫的基因组DNA进行实时荧光PCR扩增。一些实施方案中，所述实时荧光PCR扩增的程序为：95℃预变性10min；95℃保持10sec，62℃10sec，72℃保持15sec为一个循环；共45个循环；反应结束后先加热至95℃，再降至65℃，然后以每秒1％的递增至95℃直至检测荧光信号得出扩增产物的熔解曲线。一些实施方案中，所述实时荧光PCR扩增的体系为：2μL羊血液样品基因组DNA，10μLFastStartEssentialDNAGreenMaster2×，1.2μL0.6μM的上游引物，1.2μL0.6μM的下游引物，5.6μLddH2O。本发明提供的用于检测羊吕氏泰勒虫的PCR引物、检测试剂及检测方法针对吕氏泰勒虫16SrDNA基因的特异性区域，设计了2条特异性引物，上游引物如SEQIDNO:1所示，下游引物如SEQIDNO:2所示。实验表明，本发明提供的PCR引物及检测方法特异性强、敏感性高、漏检率低，可实现吕氏泰勒虫的快速、精准检测。本发明提供的检测方法简便快捷，特异性及敏感性均较高，微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定最低能检测到1.35×10-6ng的标准质粒，应用前景广阔。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示不同引物对吕氏泰勒虫基因组DNA的扩增曲线，曲线1～3依次为引物T.lu18s-RT、引物Tluw310374、引物Tasm的扩增结果；图2示不同引物扩增的熔解曲线，曲线1～3依次为引物T.lu18s-RT、引物Tluw310374、引物Tasm的结果；图3示T.lu18s-RT引物实时荧光定量PCR方法的扩增曲线，扩增曲线1～7对应的模板是含有吕氏泰勒虫靶基因片段的质粒，浓度依次为1.35×10-6ng、1.35×10-5ng、1.35×10-4ng、1.35×10-3ng、1.35×10-2ng、1.35×10-1ng、1.35ng；图4示T.lu18s-RT引物实时荧光定量PCR方法的标准曲线，横坐标表示质粒的不同浓度的对数值，纵坐标表示不同浓度质粒扩增的循环数Ct值。具体实施方式本发明公开了用于检测羊吕氏泰勒虫的PCR引物、检测试剂及检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供的用于检测羊吕氏泰勒虫的PCR引物、检测试剂及检测方法中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1SYBRGreenI实时荧光PCR检测试剂盒包括：1FastStartEssentialDNAGreenMaster2x含有SYBRGreenI化学荧光2引物T.lu-18s-RT-F和T.lu-18s-RT-R。引物T.lu-18s-RT-F和T.lu-18s-RT-R分别是按下述碱基序列由公司合成的DNA片段：T.lu-18s-RT-F：5′-CCAGCTCCAATAGCGTAT-3＇；T.lu-18s-RT-R：5′-AAGCCACAATACACCAAC-3＇。3阳性对照：由本实验室构建的含有目的基因片段的重组质粒。通过将扩增获得的吕氏泰勒虫18SrRNA基因103bp片段克隆至pMD18-T并转化DH5-α感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得阳性重组质粒。4阴性对照，为超纯水ddH2O；检测方法：1待测样本的DNA提取：取羊的血液，用商品化的DNA提取试剂盒提取基因组DNA，-20℃保存备用。2实时荧光PCR扩增：在实时荧光PCR八连管中加入病羊血液DNA，同时设阴、阳性对照，20μL反应体系为：FastStartEssentialDNAGreenMaster2x10μL，10μMT.lu-18s-RT-F1.2μL，10μMT.lu-18s-RT-R1.2μL，DNA模板2.0μL，ddH2O5.6μL，共20μL，混匀后稍离心。扩增条件为：反应结束后先加热至95℃，再降至65℃，然后以每秒1％的递增至95℃直至检测荧光信号得出扩增产物的熔解曲线。3PCR产物测序进一步验证荧光定量PCR扩增结果的正确性，以避免发生非特异性扩增现象，将实时荧光PCR产物送测序公司进行序列测定。结果分析：观察荧光曲线扩增情况：有荧光信号，且熔解曲线有特异性单峰，表示结果为阳性，即待测样品中含吕氏泰勒虫；无荧光信号，或无熔解曲线特异性单峰，表示结果为阴性，即待测样品中不含吕氏泰勒虫。为了在判断阴阳性时具有参照，在检测待测样本时同时对阴性对照品和阳性对照品进行检测。实施例2特异性测试试验特异性检测方法：分别以Tasm、Tluw310374、T.lu18s-RT为引物，按照实施例1的方法进行实时荧光PCR扩增，结果见表1和图1。表1特异性检测结果其中，引物Tasm-FTasm-R根据公开号为CN108179213A，名称为“环形泰勒虫SYBRGreenI实时荧光PCR特异性引物及检测试剂盒与检测方法”的专利合成，其序列为：Tasm-F:5′-CAA-ATT-CGA-GAC-CTA-CTA-CGA-TC-3′Tasm-R:5′-CCA-CTT-ATC-GTC-CTT-AAG-CTC-G-3′引物Tluw310根据文献《DetectionandDifferentiationofTheilerialuwenshuniandT.uilenbergiinfectioninsmallruminantsbyPCR》Yin,H.,Liu,Z.,Guan,G.,Liu,A.,Ma,N.,Ren,Q.,Luo,J.,2008.Transbound.Emerg.Dis.55,233-237.合成，序列为：Tluw310-F:5′-GGTAGGGTATTGGCCTACTGA-3′Tluw374-R:5′-TCATCCGGATAATACAAGT-3′。由表1可知，通过三对引物对环形泰勒虫、吕氏泰勒虫进行定量比较，以牛、羊阴性DNA和猪附红细胞体为阴性对照，引物Tasm对中华泰勒虫、吕氏泰勒虫和附红细胞体的阳性样品均无特异性扩增，证明该引物不能用于吕氏泰勒虫实时荧光定量PCR的检测。而Tluw310374和T.lu18s-RT都可以通过实时荧光定量PCR检测出吕氏泰勒虫，结果显示，除吕氏泰勒虫有检测到荧光信号，其余样品均未检测到荧光信号，表明两对引物具有较高的特异性。将实时荧光PCR产物送测序公司进行序列测定，测序结果与用本发明引物进行PCR扩增的鉴定结果一致。实施例3灵敏度测试试验从表1和图1～2中可以看出本申请的引物T.lu18s-RT检测到的Ct值明显比文献报道的Tluw310374引物的Ct值低，并且用ssps进行方差分析发现显著性分析p值为0.000，故p海南大学一种用于检测羊吕氏泰勒虫的PCR引物、检测试剂及检测方法MP19089822SIPOSequenceListing1.0118DNA人工序列ArtificialSequence1ccagctccaatagcgtat18218DNA人工序列ArtificialSequence2aagccacaatacaccaac18

权利要求：1.一种PCR引物，其特征在于，其上游引物如SEQIDNO:1所示，下游引物如SEQIDNO:2所示。2.权利要求1所述的PCR引物在制备羊吕氏泰勒虫的检测试剂中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为实时荧光检测试剂。4.一种用于检测羊吕氏泰勒虫的实时荧光检测试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的PCR引物。5.根据权利要求4所述的实时荧光检测试剂，其特征在于，还包括FastStartTaqDNA聚合酶、dNTPs、反应缓冲液、SYBRGreenI荧光染料和水。6.根据权利要求4所述的实时荧光检测试剂，其特征在于，还包括阴性对照品和阳性对照品；所述阴性对照品为水，所述阳性对照品为包含羊吕氏泰勒虫18SrRNA基因的重组质粒。7.一种羊吕氏泰勒虫的检测方法，其特征在于，用权利要求1所述的PCR引物对待测样品的基因组DNA进行实时荧光PCR扩增。8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光PCR扩增的程序为：95℃预变性10min；95℃保持10sec，62℃10sec，72℃保持15sec为一个循环；共45个循环；反应结束后先加热至95℃，再降至65℃，然后以每秒1％的递增至95℃直至检测荧光信号得出扩增产物的熔解曲线。9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光PCR扩增的体系为：2μL待测样品基因组DNA，10μLFastStartEssentialDNAGreenMaster2×，1.2μL0.6μM的上游引物，1.2μL0.6μM的下游引物，5.6μLddH2O。10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法的判断方法为：观察荧光曲线扩增情况：有荧光信号，且熔解曲线呈特异性单峰，表示结果为阳性，即待测样品中含吕氏泰勒虫；无荧光信号，或熔解曲线无特异性单峰，表示结果为阴性，即待测样品中不含吕氏泰勒虫。

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