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申请/专利权人：宁夏大学

摘要：本发明公开了一种基于CP8基因的猫滴虫病的实时荧光PCR诊断方法，包括以下步骤：包括引物设计与合成、猫滴虫DNA标准模板CP8‑pUCm‑TVector质粒标准品的制备、荧光定量PCR反应。本研究采用SYBRGreenⅠ法建立猫滴虫实时荧光定量PCR诊断方法，通过对荧光定量PCR各反应体系及条件进行了优化，比传统显微镜检测更敏感、迅速，提高了该病的诊断效率。

主权项：1.一种引物制备基于CP8基因的猫滴虫病的实时荧光PCR诊断试剂中的用途，其特征在于，包括以下步骤1引物设计与合成根据基因序列表所得序列，应用PrimerPrimer5.0软件设计一对特异性引物，F2：5'-ACAAGTTCGCTGCTATGACCC-3'，R2：5'-AACAACGCCCTTTTCACGCC-3'，扩增预期片段大小为137bp，引物经Primer-BLAST初步验证，后进行合成；2制备猫滴虫DNA标准模板CP8-pUCm-TVector质粒标准品；3荧光定量PCR反应反应总体系20μL，其中SYBRGreenⅠMaster荧光染料10μL，10μmolμL上下游引物各0.4μL，CP8-pUCm-TVector标准品模板2μL，用ddH2O补足至20μL；反应程序为：首先95℃预变性3min，95℃5s，59.3℃30s，65℃5s，共40个循环，最后95℃延伸5min；所述的猫滴虫DNA标准模板CP8-pUCm-TVector质粒标准品的制备方法为：将经显微镜检查确诊为猫滴虫感染的阳性粪便，严格按照粪便全基因提取试剂盒说明书提取猫球虫总基因组DNA，后用引物F2、R2进行普通PCR扩增，回收目的片段，连接pUCm-TVector克隆载体，转化至DH5a大肠杆菌感受态细胞中，涂板、通过含有氨苄抗性的LB固体培养基筛选，挑取单菌落至含有氨苄抗性的LB液体培养基中扩大培养，菌液PCR鉴定后阳性菌液提取重组质粒CP8-pUCm-TVector，进行测序，测序正确的阳性质粒采用酶标仪测定浓度，换算拷贝数，-18到-22℃保存备用，即得；所述的猫滴虫DNA标准模板CP8-pUCm-TVector质粒标准品质粒浓度为24ngμL，换算其拷贝数为2.37×1010copiesμL。

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